【技术实现步骤摘要】
本申请涉及外源dna递送，具体涉及一种重组质粒、外泌体递送载体及其应用。
技术介绍
1、腰背痛(lbp)是骨科门诊最常见的症状，严重影响各个年龄段患者的身心健康；随着世界范围内人口老龄化趋势的日渐加剧，lbp的发生率日益增加，给家庭和社会经济造成了严重负担。因lbp导致残疾，已成为残疾的第二大病因。lbp是由多种复杂病因引起的临床症状，椎间盘退变(ivdd)是引起lbp的主要原因。髓核细胞(npcs)在维持脊柱椎间盘(ivd)的健康和功能方面起着关键作用，随着年龄的增长或某些病理条件，npcs会经历衰老细胞数量的增加，这可能导致各种有害影响。并且纤维环在维持髓核组织正常生理部位中起到了关键作用，可限制发生退变的髓核组织向外突出，引发腰背痛和下肢痛。衰老的一个主要特征是npcs自我更新能力的下降，这种能力的减弱可导致增殖和新的细胞外基质(ecm)成分合成减少，进而导致椎间盘退变和椎间盘高度下降。npcs经常表现出增加的衰老，这是一种不可逆的细胞周期停滞状态衰老也会导致npcs表型的变化。大多数经历衰老的细胞会产生与衰老相关的分泌表型，导致局部炎症，从而损害ivd的整体健康。具体来说，可能存在从更多基质生成表型向更多分解代谢表型的转变，其典型特征是降解ecm的酶，如基质金属蛋白酶(mmps)的产生增加。总的来说，衰老npcs的积累有助于ivd的退行性过程，导致组织功能障碍和潜在的脊柱疾病。因此，有效缓解ivd内npcs的衰老可能为治疗ivdd和ivdd相关的lbp提供一种有希望的方法。
2、细胞衰老发生的过程中，表观遗传
3、目前，用来对抗椎间盘退变过程中的髓核细胞衰老的研究相对较少，如何研发有效的对抗椎间盘退变过程中的髓核细胞衰老的基因治疗药物，仍然是lbp领域的研究重点和难点。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种新的重组质粒、外泌体递送载体及其应用。
2、为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
3、本申请的第一方面公开了一种重组质粒，包括过表达质粒以及插入其中的oct4基因、klf4基因和sox2基因三个基因的编码序列。
4、需要说明的是，本申请创造性的将“山中因子”中的其中三个组装到一个过表达质粒中，将这样的重组质粒导入体内能够恢复衰老npcs的代谢平衡，延缓ivdd进展并缓解腰背痛的发生，为治疗ivdd和ivdd相关的lbp提供了一种新的基因治疗药物。
5、本申请的一种实现方式中，三个基因的编码序列通过柔性连接核酸片段连接，即整个外源基因的结构为oct4基因编码序列、柔性连接核酸序列、klf4基因、柔性连接核酸序列、sox2基因。
6、本申请的一种实现方式中，柔性连接核酸片段为seq id no.1所示序列，
7、seq id no.1：
8、ggcagcggcgccaccaacttcagcctgctgaagcaggccggtgacgt ggaggagaatcccggccct。
9、需要说明的是，本申请的关键在于将oct4基因、klf4基因和sox2基因三个基因(以下简称oks基因)插入过表达质粒中形成重组质粒(以下简称oks质粒)，至于多个外源基因之间如何连接或者其采用的连接序列，可以参考现有技术，seq id no.1所示序列只是本申请的一种实现方式中具体采用的连接序列，不排除还可以采用其他的连接方式或其他连接序列。
10、本申请的一种实现方式中，过表达质粒为pcdna3.1(+)过表达质粒。
11、需要说明的是，pcdna3.1(+)过表达质粒只是本申请的一种实现方式中具体采用的过表达质粒，不排除还可以采用其他能够适用于在人体中进行过表达的质粒。
12、本申请的第二方面公开了一种外泌体递送载体，其包括外泌体，该外泌体中装载有本申请的重组质粒。
13、需要说明的是，本申请创造性的采用外泌体递送本申请的重组质粒，具有稳定性好、低免疫原性和良好的组织和细胞渗透能力，能够使得本申请的重组质粒能够更好的进入细胞中，从而达到过表达本申请的oks基因的目的。
14、本申请的一种实现方式中，外泌体为大鼠骨髓间充质干细胞bmscs细胞的外泌体。
15、本申请的一种实现方式中，大鼠骨髓间充质干细胞bmscs细胞为转染有cavin2基因过表达质粒的bmscs细胞。
16、例如，将cavin2基因过表达质粒转染到大鼠骨髓间充质干细胞bmscs细胞中，过表达，得到过表达的原代bmscs细胞，从原代bmscs细胞中提取bmscs来源的外泌体，即工程化改造外泌体(m-exo)，用于装载本申请的重组质粒。因此，本申请优选的外泌体为工程化改造外泌体，即cavin2蛋白修饰在外泌体表面。
17、需要说明的是，本申请优选的采用工程化改造外泌体，尤其是cavin2蛋白修饰的外泌体，是因为本申请研究发现，cavin2蛋白修饰的工程化改造外泌体能够提高衰老细胞对外泌体的内吞能力，更利于本申请的重组质粒进入衰老细胞内，从而更好的过表达本申请的oks基因，进而起到更好的椎间盘退变治疗效果。
18、本申请的一种实现方式中，cavin2基因过表达质粒为插入cavin2基因的编码序列的pires2-egfp过表达质粒。
19、需要说明的是，pires2-egfp过表达质粒只是本申请的一种实现方式中具体采用的过表达质粒，不排除还可以采用其他能够适用于外泌体工程化改造的过表达质粒。
20、本申请的第三方面公开了本申请的重组质粒或者本申请的外泌体递送载体在制备预防和/或治疗椎间盘退变或者椎间盘退变导致的疾病的药物中的应用。
21、需要说明的是，本申请的外泌体递送载体可以直接作为预防和/或治疗椎间盘退变或者椎间盘退变导致的疾病的药物使用，包括髓核组织、纤维环和软骨终板等组织的修复。至于本申请的重组质粒，可以采用现有的其他核酸递送系统；因此，本申请的重组本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组质粒，其特征在于：包括过表达质粒以及插入其中的Oct4基因、Klf4基因和Sox2基因三个基因的编码序列。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述三个基因中，各基因的编码序列通过柔性连接核酸片段连接。
3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述柔性连接核酸片段为Seq IDNo.1所示序列，
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组质粒，其特征在于：所述过表达质粒为pcDNA3.1(+)过表达质粒。
5.一种外泌体递送载体，其特征在于：包括外泌体，所述外泌体中装载有权利要求1-4任一项所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的外泌体递送载体，其特征在于：所述外泌体为大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs细胞的外泌体。
7.根据权利要求6所述的外泌体递送载体，其特征在于：所述大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs细胞为转染有Cavin2基因过表达质粒的BMSCs细胞。
8.根据权利要求7所述的外泌体递送载体，其特征在于：所述Cavin2基因过表达质粒为插入Cavin2-Lamp2b基因
9.权利要求1-4任一项所述的重组质粒或者权利要求5-8任一项所述的外泌体递送载体在制备预防和/或治疗椎间盘退变或者椎间盘退变导致的疾病的药物中的应用，所述疾病包括髓核组织或纤维环的衰老相关表型。
10.一种用于预防和/或治疗椎间盘退变或者椎间盘退变导致的疾病的药物，其特征在于：所述药物中含有权利要求1-4任一项所述的重组质粒或者权利要求5-8任一项所述的外泌体递送载体，所述疾病包括髓核组织或纤维环的衰老相关表型。
...【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，其特征在于：包括过表达质粒以及插入其中的oct4基因、klf4基因和sox2基因三个基因的编码序列。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述三个基因中，各基因的编码序列通过柔性连接核酸片段连接。
3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述柔性连接核酸片段为seq idno.1所示序列，
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组质粒，其特征在于：所述过表达质粒为pcdna3.1(+)过表达质粒。
5.一种外泌体递送载体，其特征在于：包括外泌体，所述外泌体中装载有权利要求1-4任一项所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的外泌体递送载体，其特征在于：所述外泌体为大鼠骨髓间充质干细胞bmscs细胞的外泌体。
7.根据权利要求6所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴德成，马文政，刘洪梅，王挽涛，
申请(专利权)人：南方科技大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。