【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织工程和生物制造，具体涉及一种基于微凝胶的生物打印基质、其制备方法和应用。
技术介绍
1、挤出式生物3d打印通常将水凝胶材料与细胞混合作为生物墨水，按照预定义路径，在空气中进行挤出打印，通过层层堆积利用多材料复合打印形成具有复杂结构的3d组织与器官。而对于脉管系统的构建，将牺牲材料进行挤出打印，打印后，通过溶芯将牺牲材料去除，形成脉管系统。两种打印策略在大尺度组织和器官(厘米级)的构建是非常必要的。
2、虽然挤出式生物3d打印技术具有制造复杂组织结构的潜力，是目前主流的打印工艺，但这种工艺中，包裹细胞的水凝胶材料受到一定的粘度限制，粘度较低时，可以保证细胞活率，但打印精度受限，水凝胶粘度较高时，包裹的细胞会在喷嘴处受到剪切力，影响细胞的存活率。因此，挤出过程中，剪切力大小受水凝胶粘度和流变学性质的影响，水凝胶粘度越大，剪切力越大。而粘度太小，不利于形态维持，挤出成丝，降低打印的分辨率。挤出生物打印极大受限于水凝胶的性质和浓度范围，对于大体积组织打印，挤出打印效率同时影响细胞的活率，限制打印的应用。
3、另一方面，水凝胶的浓度影响包裹细胞的行为，包括2d贴附、增殖，3d内细胞存活、增殖、迁移及自组装行为。对于人工合成和天然聚合物分子链来讲，浓度越大，链与链之间的交联越致密，孔隙结构越小，严重限制细胞在三维空间的延展、迁移。相反，浓度越低，分子链间交联形成的孔隙率增大，为细胞的迁移组装提供空间，但机械性能下降，不能满足生理血流的剪切力，进而限制通过与体内血管直接吻合移植的体内移植策略的可行性。
4、因此，水凝胶机械性质、生物活性以及构建大体积血管组织的打印策略、移植策略等会限制体外构建组织的转移、转化。提供一种可打印、满足内皮细胞组装行为，可以耐受血流剪切力的基质是尤为必要的。
技术实现思路
1、在体外仿生构建可植入的血管化组织/器官时，需要水凝胶同时满足生物活性方面的要求和力学性能方面的要求，具体来说，就是既能保证内皮细胞的血管发生和血管生成，又可以耐受生理血流对血管壁的剪切力。然而，使用均一水凝胶构建策略无法同时满足上述两方面的要求。
2、针对以上问题，本专利技术提供可光交联的微凝胶与光交联分子和生物活性物质形成的复合水凝胶基质。利用这种复合基质，可以结合生物挤出打印/嵌入式打印策略，利用溶芯法构建脉管系统，其中复合基质作为嵌入式打印基质构建脉管系统时不存在剪切力对细胞活性影响的问题；挤出打印则可以利用多材料复合打印策略，复合材料满足内皮细胞的血管生成和血管发生，构建具有内承压结构的大体积血管组织。
3、由此，本申请提供了以下专利技术：
4、在一个方面，本申请提供了一种生物打印基质，包含微凝胶、一种或多种光交联分子，以及一种或多种生物活性物质；所述微凝胶为生物相容性高分子形成的微凝胶(包括但不限于gelma、hama、壳聚糖、明胶、蛋白质或聚乙二醇形成的微凝胶)；所述光交联分子为含有光反应基团的高分子；所述生物打印基质经紫外光照能够形成具有异质微结构的水凝胶。
5、本专利技术中，“异质微结构”指的是水凝胶具有差异性的内部结构，对于细胞来说，即形成差异性的微观环境(异质微环境)。对于本专利技术来说，生物打印基质经光照后形成的水凝胶中，由于颗粒(微凝胶颗粒)内部的交联结构与颗粒-高分子(微凝胶颗粒与光交联分子)间形成的交联结构不同，使得水凝胶内部的孔隙面积、刚度等方面存在差异。
6、在一些更为具体的实施方式中，微凝胶与光交联分子以及生物活性物质之间通过物理包裹和化学交联两种方式形成复合水凝胶，其中，微凝胶形成内部具有致密交联结构的微球，微凝胶与光交联分子之间形成化学交联，与生物活性物质形成物理包裹。这样的复合方式形成了水凝胶的异质微结构。
7、在一些更为具体的实施方式中，本专利技术的生物打印基质是以gelma微凝胶为基础的可光交联复合凝胶体系。gelatin(明胶)是胶原部分水解后的产物，gelma(甲基丙烯酰化明胶)是一种双键改性明胶，可通过紫外及可见光在光引发剂作用下交联固化。gelma兼具天然和合成生物材料的特征，具有适于细胞生长和分化的三维结构、优异的生物相容性和细胞反应特性，而且具备良好的温敏凝胶特性和可降解性，机械性能可调。
8、微凝胶指的是内部具有交联结构的凝胶颗粒，也可以理解为包含由化学交联的三维聚合物网络组成的胶体的凝胶颗粒。微凝胶颗粒的大小可以在纳米或微米级别(例如1～10nm、10～100nm、100～200nm、200～500nm、500～1000nm、1～10μm、10～100μm、100～200μm、200～500μm或500～1000μm)。
9、在一些实施方案中，可以采用具有低屈服应力、剪切变稀性质的微凝胶。
10、屈服应力是指，对于某些非牛顿流体，施加的剪切应力较小时流体只发生变形，不产生流动，当剪切应力增大到某一定值时流体才开始流动，此时的剪切应力称为该流体的屈服应力。
11、具体而言，在对微凝胶施加临界剪切应力之后，其开始流动。这种行为可以使用流变仪来分析，当剪切应力低于屈服应力时，微凝胶表现为固体，当剪切应力高于屈服应力时，微凝胶展现为流体。在这种施加应力的水平下，微凝胶随着增加的剪切速率而经受粘度的快速降低，证明了剪切变稀的性质。当保持高于临界屈服应力的剪切应力时，颗粒将会继续滑过彼此并且展现出流体状行为。当剪切力降低至低于临界屈服应力时，微凝胶间通过与初始将它们保持在一起的相同的力而彼此再粘附。
12、采用具有低屈服应力、剪切变稀性质的材料可以赋予打印基质自愈合性质，满足嵌入式打印的需求。在一些实施方案中，本专利技术使用的微凝胶具有剪切变稀的性质，其屈服应力为10～200pa(例如10～20pa、20～30pa、30～50pa、50～100pa、100～150pa或150～200pa)。可以使用流变仪测量微凝胶的屈服应力，测量方法可以是流变仪说明书所记载的方法，也可以是本领域相关的国家标准或国际标准所规定的方法。
13、在一些实施方案中，本专利技术使用的微凝胶为gelma微凝胶。
14、可以通过对gelma的修饰度进行选择来调控打印基质的力学性能，gelma中ma的含量越低，越不容易产生交联。在一些实施方案中，gelma的修饰度为45％～90％(例如45％～50％、50％～60％、60％～70％、70％～75％、75％～80％或80％～90％)。修饰度在此范围内的gelma微凝胶形成的基质具有适合打印的力学性能。
15、微凝胶可以通过复合凝聚法制得，所述复合凝聚法包括：利用复合凝聚物降低生物相容性高分子在溶剂中的溶解度，使所述生物相容性高分子析出形成微凝胶。作为复合凝聚物的材料可以是与所述生物相容性高分子不相容且能产生静电作用的高分子，例如，阿拉伯胶与gelma不相容，可以作为gelma的复合凝聚物。在一些实施方案中，使用gelma形成微凝胶，复合凝聚法使用的溶剂可以是gelma的良溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物打印基质，包含微凝胶、一种或多种光交联分子以及一种或多种生物活性物质；所述微凝胶为生物相容性高分子形成的微凝胶(包括但不限于GelMA、HAMA、壳聚糖、明胶、蛋白质或聚乙二醇形成的微凝胶)；所述光交联分子为含有光反应基团的高分子；所述生物打印基质经紫外光照能够形成具有异质微结构的水凝胶。
2.权利要求1的生物打印基质，在光照下，所述微凝胶与光交联分子以及生物活性物质之间通过物理包裹和化学交联两种方式形成复合水凝胶，其中，所述微凝胶形成内部具有致密交联结构的微球，所述微凝胶与光交联分子之间形成化学交联，与生物活性物质形成物理包裹。
3.权利要求1-2任一项的生物打印基质，所述微凝胶具有剪切变稀的性质，其屈服应力为10～200Pa；优选地，所述微凝胶为GelMA微凝胶，GelMA的修饰度为45％～90％。
4.权利要求1-3任一项的生物打印基质，所述微凝胶通过复合凝聚法制得，所述复合凝聚法包括：利用复合凝聚物降低所述生物相容性高分子在溶剂中的溶解度，使所述生物相容性高分子析出形成微凝胶，所述复合凝聚物为与所述生物相容性高分子不相容且能
5.权利要求1-4任一项的生物打印基质，所述GelMA微凝胶通过包含如下步骤的方法制得：
6.权利要求1-5任一项的生物打印基质，所述光交联分子为含有光反应基团的生物相容性高分子；
7.权利要求1-6任一项的生物打印基质，所述生物活性物质为蛋白质(例如胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白)或细胞外基质(例如Matrigel)；
8.权利要求1-7任一项的生物打印基质，所述紫外光的照射强度为2-10mW/cm2；优选地，使用波长为365nm或365nm以上的紫外光照射。
9.权利要求1-8任一项的生物打印基质，所述生物打印基质还包含光引发剂；
10.权利要求1-9任一项的生物打印基质，所述生物打印基质还包含细胞；
11.权利要求1-10任一项的生物打印基质，其中，所述微凝胶的质量浓度大于等于2.5g/100mL，所述生物打印基质为嵌入式打印基质或挤出打印基质；或者，所述微凝胶的质量浓度低于2.5g/100mL，所述生物打印基质为挤出打印基质；
12.一种制备权利要求1-11任一项所述的生物打印基质的方法，所述方法包括：将所述生物打印基质包含的各成分混合均匀，任选地，所述方法还包括在紫外光下照射所述生物打印基质以产生交联。
13.一种试剂盒，其包含权利要求1-11任一项所述的生物打印基质。
14.权利要求1-11任一项所述的生物打印基质在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于体外3D生物打印或体外仿生结构体构建。
15.权利要求1-11任一项所述的生物打印基质用于体外3D生物打印或体外仿生结构体构建的用途，优选地，所述用途用于非诊断或治疗目的。
16.一种生物打印方法，所述方法包括使用权利要求1-11任一项所述的生物打印基质或使用权利要求13的试剂盒；
17.权利要求16的生物打印方法，所述方法包括：使用权利要求1-11任一项所述的生物打印基质作为第一打印墨水，将牺牲墨水作为第二打印墨水，通过挤出打印形成预定的结构；使用紫外光照射所述预定结构以使所述生物打印基质产生交联；除去牺牲墨水，获得生物打印产品。
18.权利要求16的生物打印方法，所述方法包括：将牺牲墨水挤出打印于权利要求1-11任一项所述的生物打印基质中；使用紫外光照射所述生物打印基质以产生交联；除去牺牲墨水，获得生物打印产品。
19.由权利要求16-18任一项生物打印方法获得的产品；
20.权利要求1-11任一项所述的生物打印基质、权利要求13的试剂盒或权利要求19的产品的用途，所述用途为病损组织或器官的修复、药物开发与筛选、或病理研究模型的制备；优选地，所述用途用于非诊断或治疗目的。
...【技术特征摘要】
1.一种生物打印基质，包含微凝胶、一种或多种光交联分子以及一种或多种生物活性物质；所述微凝胶为生物相容性高分子形成的微凝胶(包括但不限于gelma、hama、壳聚糖、明胶、蛋白质或聚乙二醇形成的微凝胶)；所述光交联分子为含有光反应基团的高分子；所述生物打印基质经紫外光照能够形成具有异质微结构的水凝胶。
2.权利要求1的生物打印基质，在光照下，所述微凝胶与光交联分子以及生物活性物质之间通过物理包裹和化学交联两种方式形成复合水凝胶，其中，所述微凝胶形成内部具有致密交联结构的微球，所述微凝胶与光交联分子之间形成化学交联，与生物活性物质形成物理包裹。
3.权利要求1-2任一项的生物打印基质，所述微凝胶具有剪切变稀的性质，其屈服应力为10～200pa；优选地，所述微凝胶为gelma微凝胶，gelma的修饰度为45％～90％。
4.权利要求1-3任一项的生物打印基质，所述微凝胶通过复合凝聚法制得，所述复合凝聚法包括：利用复合凝聚物降低所述生物相容性高分子在溶剂中的溶解度，使所述生物相容性高分子析出形成微凝胶，所述复合凝聚物为与所述生物相容性高分子不相容且能产生静电作用的高分子；
5.权利要求1-4任一项的生物打印基质，所述gelma微凝胶通过包含如下步骤的方法制得：
6.权利要求1-5任一项的生物打印基质，所述光交联分子为含有光反应基团的生物相容性高分子；
7.权利要求1-6任一项的生物打印基质，所述生物活性物质为蛋白质(例如胶原蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白)或细胞外基质(例如matrigel)；
8.权利要求1-7任一项的生物打印基质，所述紫外光的照射强度为2-10mw/cm2；优选地，使用波长为365nm或365nm以上的紫外光照射。
9.权利要求1-8任一项的生物打印基质，所述生物打印基质还包含光引发剂；
10.权利要求1-9任一项的生物打印基质，所述生物打印基质...
【专利技术属性】
技术研发人员：顾奇，王新环，刘鑫，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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