【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外核酸检测领域，尤其是涉及一种基于纳米孔靶向测序技术检测mlh1基因启动子甲基化的方法及检测试剂盒。
技术介绍
1、dna甲基化是最主要的表观修饰，在基因表达调控中发挥着关键作用，甲基化修饰作为转录机制中的分子开关参与生物生长发育及衰老的各个过程。许多疾病发生发展的病理过程也都伴随着甲基化模式的改变，比如癌症、神经系统紊乱、糖尿病等。在肿瘤的发生发展过程中，由于cpg岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进一步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。此外，除了在肿瘤组织中检测甲基化以外，大量研究证明检测肿瘤细胞在破裂和死亡时释放到血液及其他体液中的循环肿瘤dna(circulating tumor dna,ctdna)的甲基化模式，可以经济、无创、快速的实时跟踪肿瘤的动态变化，所以甲基化可以作为一个比较理想的肿瘤早期诊断的生物标志物和预后评估指标。因此dna甲基检测可作为肿瘤的早期筛查、风险评估、诊断、分期分型、预后判断及治疗监测的依据。
2、错配修复(mismatch repair，mmr)是指在含有错配碱基的dna分子中，使核苷酸序列恢复正常的修复方式。当mmr基因发生胚系突变或甲基化时将导致mmr功能下降，致使dna序列中的碱基错配、缺失或插入不能被修复。mlh1(mutl homolog1)基因是dna错配修复基因的重要组成部分，其表达产物可识别和修复基因突变，维护基因组的稳定性。mlh1基因启动子甲基化
3、目前，检测mlh1基因启动子甲基化的常用方法有：甲基化特异性pcr(msp)、亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)、荧光定量法和甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)。
4、其中，甲基化特异性pcr(msp)法通过使用两对引物分别扩增经亚硫酸盐处理的样本和未经处理的样本，由扩增结果来判断目标区域是否存在甲基化，该法无需特殊仪器，应用较为广泛，但检测结果的好坏严重依赖引物设计，不能做到定量检测，且存在较高的假阳性风险。
5、亚硫酸氢盐测序pcr(bsp)法主要是通过pcr联合sanger测序技术来检测甲基化状态。bsp方法针对亚硫酸盐转化后的dna序列设计不包含cg位点的引物进行pcr，然后将产物连接到载体上，转化至大肠杆菌中培养，从阳性克隆中挑单克隆测序，根据测序结果统计启动子cg位点的甲基化水平。但由于该方法需要挑大量单克隆测序，操作繁琐，检测周期长，因此不适合大批量检测，且亚硫酸盐处理不完全容易造成假阳性结果。
6、荧光定量法是基于msp开发的技术，主要是在检测过程中加入taqman探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但是如果检测较多的甲基化位点，也只能做到整体化分析，因此该法不适用于大量样本较多位点的检测。
7、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(ms-hrm)是通过将单碱基序列的差异转变为熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，但是这种方法对仪器的要求颇高，需要带hrm模块的荧光定量pcr仪，而且该法只能分析片段整体甲基化状态，而不能明确每个cpg位点的甲基化状态。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于针对mlh1基因启动子甲基化状态的检测技术不足，提供一种快速高效获得样本dna最原始的甲基化状态的甲基化检测试剂盒。通过将纳米孔长读长测序技术和cas9体外切割技术相结合来检测mlh1基因启动子甲基化位点的甲基化状态，针对mlh1启动子区域设计四条cas9靶向切割探针crrna，在目标区域上下游各切割两次，包含mlh1基因启动子区域及其侧翼区域。
2、本专利技术的第二目的在于提供一组靶向mlh1基因启动子的crrna间隔序列。
3、本专利技术的第三目的在于提供所述靶向crrna的间隔序列在mlh1基因启动子甲基化的检测中的应用。
4、本专利技术的第四目的在于提供一种基于纳米孔靶向测序技术检测mlh1基因启动子甲基化的方法。
5、为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术手段：
6、本专利技术提供一组靶向mlh1基因启动子的crrna间隔序列，其核苷酸序列如序列表seq id no.1～no.4所示，具体如下：
7、seq id no.1:accgggcuccauuucaguug；
8、seq id no.2:guagauuccugucaaugcuc；
9、seq id no.3:gguuuuacuuacccugaucc；
10、seq id no.4:gggucacuaauuuaacaaua。
11、本专利技术提供一种含有所述靶向mlh1基因启动子的crrna间隔序列的mlh1基因甲基化检测试剂盒。
12、所述甲基化检测试剂盒包括：crrna·tracrna mix与cas9酶室温孵育形成的rnps、datp、neb taq聚合酶、adapter mix、ligation buffer、nebnext quick t4 dnaligase、flush tether、flush buffer、sequencing buffer、loading beads。
13、所述crrna·tracrnamix与cas9酶室温孵育形成的rnps由以下方法制备：
14、1)将靶向mlh1基因启动子的crrna间隔序列等体积混合成crrnapool；
15、2)将等物质量的crrnapool与tracrna混合，再加入buffer，在热循环仪中加热后室温冷却退火形成crrna·tracrnamix；
16、3)将crrna·tracrna mix与cas9酶室温孵育形成rnps。
17、在步骤2)中，所述热循环仪中加热的温度为95℃，加热时间5min。
18、在步骤3)中，所述室温孵育的时间为30min。
19、本专利技术提供所述靶向mlh1基因启动子的crrna间隔序列或者所述检测试剂盒在检测mlh1基因启动子甲基化中的应用。
20、一种基于纳米孔靶向测序技术检测mlh1基因启动子甲基化的方法，包括以下步骤：
21、(1)靶基因的crrna设计
22、以mlh1基因启动子(其中包含转录起始位点周围的cpg二核苷酸)为目标区域，在该区域两端的每一侧分别设计两条crrna，评估的剪切策略对靶向富集效率的影响；
23、(2)cas9 rnp复合物的制备
24、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组靶向MLH1基因启动子的crRNA间隔序列，其特征在于其核苷酸序列如序列表SEQID No.1～No.4所示，具体如下：
2.一种含有如权利要求1所述靶向MLH1基因启动子的crRNA间隔序列的MLH1基因甲基化检测试剂盒。
3.如权利要求2所述MLH1基因甲基化检测试剂盒，其特征在于所述甲基化检测试剂盒包括：crRNA·tracRNA mix与Cas9酶室温孵育形成的RNPs、dATP、NEB Taq聚合酶、AdapterMix、Ligation Buffer、NEBNext Quick T4 DNA Ligase、Flush Tether、Flush Buffer、Sequencing Buffer、Loading Beads。
4.如权利要求3所述MLH1基因甲基化检测试剂盒，其特征在于所述crRNA·tracRNAmix与Cas9酶室温孵育形成的RNPs由以下方法制备：
5.如权利要求4所述MLH1基因甲基化检测试剂盒，其特征在于在步骤2)中，所述热循环仪中加热的温度为95℃，加热时间5min。
6.如权
7.如权利要求1所述靶向MLH1基因启动子的crRNA间隔序列或者权利要求2所述检测试剂盒在检测MLH1基因启动子甲基化中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一组靶向mlh1基因启动子的crrna间隔序列，其特征在于其核苷酸序列如序列表seqid no.1～no.4所示，具体如下：
2.一种含有如权利要求1所述靶向mlh1基因启动子的crrna间隔序列的mlh1基因甲基化检测试剂盒。
3.如权利要求2所述mlh1基因甲基化检测试剂盒，其特征在于所述甲基化检测试剂盒包括：crrna·tracrna mix与cas9酶室温孵育形成的rnps、datp、neb taq聚合酶、adaptermix、ligation buffer、nebnext quick t4 dna ligase、flush tether、flush buffer、seque...
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