【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及丝状真菌菌体形态控制基因，利用这些基因构建有机酸生产菌株，及在有机酸生产中的应用。
技术介绍
1、丝状真菌尤其是黑曲霉在制备相关有机酸例如柠檬酸、苹果酸、琥珀酸等中具有特别优势，其中，黑曲霉生产的柠檬酸全球年产量达200万吨，产值超过20亿美元，并以每年5％的速度递增(tong et al.,systems metabolic engineering for citric acidproduction by aspergillus niger in the post-genomic era.microb cellfact.2019)。由于黑曲霉的遗传改造难度较大，早期的研究主要集中在发酵工艺的优化以提高黑曲霉的产量，如碳源、氮源、ph等发酵条件的不断优化。近年来，随着代谢工程的发展以及黑曲霉遗传操作工具的不断开发，通过基因工程改造提高柠檬酸产量的报道也陆续出现，改造的靶点包括增加其底物乙酰辅酶a的供应、增加柠檬酸的外排、增加呼吸链调节等等。这些遗传改造在不同程度上增加了黑曲霉柠檬酸的产量(tong et al.,systemsmetabolic engineering for citric acid production by aspergillus niger in thepost-genomic era.microb cell fact.2019)。
2、然而，由于在真菌的代谢过程中，有机酸如柠檬酸、苹果酸、琥珀酸的合成途径较短，且这些有机酸都是三羧酸循环的重要中间产物，现有
技术实现思路
1、为解决当前黑曲霉可改造的遗传靶点少的问题，本专利技术通过对柠檬酸合酶基因共表达网络的分析，筛选获得了41个形态控制相关的内源基因，进一步的分析发现，菌体形态控制的16个内源性基因的失活，或4个内源性基因的过表达可以提高黑曲霉有机酸尤其是柠檬酸的产量，显著提高菌株的产酸水平，在此基础上完成本专利技术。
2、本专利技术首先提供形态控制基因在改变丝状真菌菌体形态中的应用，其所述形态控制基因编码的多肽的氨基酸序列如seq id no：1至20任一所示。
3、具体地，所述应用是所述形态控制基因的失活导致菌株在菌落直径显著变小或菌落表面褶皱增加。
4、优选地，所述丝状真菌是黑曲霉(aspergilusniger)，构巢曲霉(aspergillusnidulans)，米曲霉(aspergillus oryzae)，产黄青霉(penicillium chrysogenum)，里氏木霉(trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)等菌株中的任一种，最优选黑曲霉。
5、本专利技术进一步提供形态控制基因在丝状真菌产有机酸中的应用，所述形态控制基因编码的多肽的氨基酸序列如seq id no：1至20任一所示。
6、优选地，所述丝状真菌是黑曲霉(aspergilusniger)，构巢曲霉(aspergillusnidulans)，米曲霉(aspergillus oryzae)，产黄青霉(penicillium chrysogenum)，里氏木霉(trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)等菌株中的任一种，最优选黑曲霉。
7、进一步优选地，所述有机酸为柠檬酸、苹果酸，琥珀酸，衣康酸，富马酸，最优选为柠檬酸。
8、具体地，在出发菌株中将如seq id no：1至16任一所示氨基酸序列的多肽的编码基因失活，以提高其有机酸生产能力；或者在出发菌株中对如seq id no：17至20任一所示氨基酸序列的多肽的编码基因进行过表达，以提高其有机酸生产能力。
9、本专利技术提供一种提高丝状真菌产有机酸能力的重组菌株的制备方法，其在出发菌株中将如seq id no：1至16任一所示氨基酸序列的多肽的编码基因失活，以提高其有机酸生产能力；或者在出发菌株中对如seq id no：17至20任一所示氨基酸序列的多肽的编码基因进行过表达，以提高其有机酸生产能力。
10、优选地，所述丝状真菌是黑曲霉(aspergilusniger)，构巢曲霉(aspergillusnidulans)，米曲霉(aspergillus oryzae)，产黄青霉(penicillium chrysogenum)，里氏木霉(trichoderma reesei)，玉蜀黍黑粉菌(ustilago maydis)，嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)等菌株中的任一种，最优选黑曲霉。
11、进一步优选地，所述有机酸为柠檬酸、苹果酸，琥珀酸，衣康酸，富马酸，最优选为柠檬酸。
12、进一步地，在出发菌株中对柠檬酸外排蛋白进行过表达；最优选，所述柠檬酸外排蛋白的氨基酸序列如seq id no：21所示。
13、更进一步地，在出发菌株中对四碳二羧酸外排蛋白进行过表达；最优选，所述四碳二羧酸外排蛋白的氨基酸序列如seq id no：22所示。
14、本专利技术最后提供所述的制备方法得到的重组菌株。
15、本专利技术通过柠檬酸合酶基因共表达网络的分析筛选多个形态控制基因，并通过实验证实，通过失活所述16个基因或者过表达其中4个基因，可以提高重组菌株产有机酸尤其是柠檬酸的能力，在实际生产中可提高柠檬酸的生产能力，降低生产成本，具有较好的工业应用潜能。同时，本专利技术挖掘到的菌体形态控制基因，为构建高效的黑曲霉工程菌株提供了新的遗传改造靶点，将会加快本领域的技术进步。
16、术语定义...
【技术保护点】
1.形态控制基因在改变丝状真菌菌体形态中的应用，其特征在于，所述形态控制基因编码的多肽的氨基酸序列选自下述a）或b）：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是所述形态相关基因的失活导致菌株在菌落直径显著变小或菌落表面褶皱增加。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丝状真菌是黑曲霉（Aspergilusniger），构巢曲霉（Aspergillus nidulans），米曲霉（Aspergillus oryzae），产黄青霉（Penicillium chrysogenum），里氏木霉（Trichoderma reesei），玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis），嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila）菌株中的任一种，优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉，最优选黑曲霉。
4.形态控制基因在丝状真菌产有机酸中的应用，其特征在于，所述形态控制基因编码的多肽的氨基酸序列选自下述a）至b）中的至少一组：
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在出发菌株中将如SEQ ID NO：1至16任
6.一种提高丝状真菌产有机酸能力的重组菌株的制备方法，其特征在于，在出发菌株中将如SEQ ID NO：1至16任一所示氨基酸序列的多肽的编码基因失活，以提高其有机酸生产能力；或者在出发菌株中对如SEQ ID NO：17至20任一所示氨基酸序列的多肽的编码基因进行过表达，以提高其有机酸生产能力；
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，进一步地，在出发菌株中对柠檬酸外排蛋白进行过表达；或在出发菌株中对柠檬酸外排蛋白进行失活，同时对四碳二羧酸外排蛋白进行过表达；
8.如权利要求6或7所述的制备方法得到的重组菌株。
9.一种生产有机酸的方法，所述方法包括培养权利要求8中的重组菌株或，使之生产有机酸；优选地，还包括从发酵液中分离有机酸的步骤；
10.如权利要求8所述的重组菌株、权利要求9所述的生产方法在生产有机酸中的用途。
...【技术特征摘要】
1.形态控制基因在改变丝状真菌菌体形态中的应用，其特征在于，所述形态控制基因编码的多肽的氨基酸序列选自下述a）或b）：
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用是所述形态相关基因的失活导致菌株在菌落直径显著变小或菌落表面褶皱增加。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述丝状真菌是黑曲霉（aspergilusniger），构巢曲霉（aspergillus nidulans），米曲霉（aspergillus oryzae），产黄青霉（penicillium chrysogenum），里氏木霉（trichoderma reesei），玉蜀黍黑粉菌（ustilago maydis），嗜热毁丝霉（myceliophthorathermophila）菌株中的任一种，优选黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉、里氏木霉，最优选黑曲霉。
4.形态控制基因在丝状真菌产有机酸中的应用，其特征在于，所述形态控制基因编码的多肽的氨基酸序列选自下述a）至b）中的至少一组：
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在出发菌株中将如seq id no：...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙际宾，郑小梅，郑平，陈美玲，杜鹏，周文娟，车斌，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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