【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，具体涉及基于重组酶介导等温核酸扩增(raa)的猴痘病毒核酸检测方法。
技术介绍
1、猴痘病毒(monkeypox virus，mpxv)是一种人畜共患的病原体，属于痘病毒科正痘病毒属，为线性双链dna，基因组长度为197kb。
2、重组酶介导的扩增技术(recombinase-aided amplification,raa)，具有简便、灵敏度高、速度快等特点，可在恒温条件下进行病原体检测，无需先进的仪器设备。成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats,crispr)及相关蛋白(crispr-associated，cas)系统是细菌的一种适应性免疫系统，利用其反式切割活性，能够特异性识别靶dna，有利于开发体外核酸检测技术。
3、目前，已有实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chainreaction，qpcr)、病毒分离培养、电子显微镜观察、聚合酶链反应(polymerase chainreaction，pcr)等方法用于猴痘诊断，其中qpcr是目前猴痘检测的金标准。但qpcr检测时间长，且需要特殊仪器设备、高标准的实验室环境以及专业技术人员，制约了其在不发达或欠发达地区的广泛应用。因此迫切需要建立快速、准确、可自检的mpxv核酸检测方法。
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本专利技术的目
2、为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、提供基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，在39℃，30min恒温条件下特异识别并扩增目标样本的dna片段，raa扩增引物选自n4r基因，通过raa结合crispr/cas12a、实时raa和raa结合侧流条带三种方法中的任一方法检测猴痘病毒核酸。
4、进一步地，基于raa-crispr/cas12a的猴痘病毒核酸检测方法包括以下步骤：
5、步骤1、以样本中的核酸作为模板进行raa扩增，raa扩增引物选自n4r基因，其上游引物序列如seq id no.1所示，其下游引物序列如seq id no.2所示；
6、步骤2、使用步骤1获得的raa扩增产物，cas12a蛋白，crrna，荧光标记的ssdna在crispr/cas12a系统检测体系里反应；
7、步骤3、对步骤2的反应体系进行荧光强度的检测。
8、进一步地，步骤2中，crrna的序列选自seq id no.3序列。
9、进一步地，基于实时raa的猴痘病毒核酸检测方法包括以下步骤：
10、步骤1、以样本中的核酸作为模板进行raa扩增，raa扩增引物选自n4r基因，其上游引物序列如seq id no.1所示，其下游引物序列如seq id no.2所示，其探针序列如seq idno.4所示。
11、步骤2、对步骤1的反应体系进行荧光强度的检测。
12、进一步地，基于raa结合侧流条带的猴痘病毒核酸检测方法包括以下步骤：
13、步骤1、以样本中的核酸作为模板进行raa扩增，raa扩增引物选自n4r基因，其上游引物序列如seq id no.1所示，其下游引物序列如seq id no.6所示，其探针序列如seq idno.5所示。
14、步骤2、对步骤1的反应体系进行结果检测。
15、进一步地，光基团选自以下一种或多种：fam、cy5、vic、hex。
16、进一步地，荧光淬灭基团选自以下一种或多种：bhq1、bhq2、tamra。
17、本专利技术的有益效果为：
18、本专利技术利用raa建立了猴痘病毒的等温扩增检测方法，该方法不仅具有较高的灵敏性，可以检测低至1拷贝/反应的猴痘病毒核酸，同时与正痘病毒属中的痘苗病毒、鼠痘病毒均无交叉反应，具有较好的特异性。
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1.基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，在39℃，30min恒温条件下特异识别并扩增目标样本的DNA片段，RAA扩增引物选自N4R基因，通过RAA结合CRISPR/Cas12a、实时RAA和RAA结合侧流条带三种方法中的任一方法检测猴痘病毒核酸。
2.根据权利要求1所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，步骤2中，crRNA的序列选自SEQ ID NO.3序列。
4.根据权利要求1所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，基于实时RAA的猴痘病毒核酸检测方法包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，基于RAA结合侧流条带的猴痘病毒核酸检测方法包括以下步骤：
6.根据权利要求2-4任一所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒
7.根据权利要求2-4任一所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，荧光淬灭基团选自以下一种或多种：BHQ1、BHQ2、TAMRA。
...【技术特征摘要】
1.基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，在39℃，30min恒温条件下特异识别并扩增目标样本的dna片段，raa扩增引物选自n4r基因，通过raa结合crispr/cas12a、实时raa和raa结合侧流条带三种方法中的任一方法检测猴痘病毒核酸。
2.根据权利要求1所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，基于raa-crispr/cas12a的猴痘病毒核酸检测方法包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于重组酶介导等温核酸扩增的猴痘病毒核酸检测方法，其特征在于，步骤2中，crrna的序列选自seq id no.3序列。
4.根据...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文玲，谭文杰，罗美惠，赵莉，吴长城，田厚文，黄保英，陆柔剑，任皎，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
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