【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物生物，具体涉及一种携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
1、中性粒细胞(neutrophils，nes)作为宿主抵抗病原体的防线，一个关键特征就是能将一种名为中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps，nets)的特殊结构挤压到周围环境中(semin immunol 57:101595.)。nets是由包裹着颗粒蛋白的染色质dna细丝组成，可以作为nes抗菌杀菌的武器；在其形成的过程中，肽酰精氨酸脱氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4，pad4)是必不可少的(nat rev immunol 18(2):134-147；semin cancer biol 79:91-104.)。近年来，肿瘤相关中性粒细胞(tumor associatedneutrophils,tans)的报道使得人们对nes的功能多样性产生了新的认识。在肿瘤中，癌细胞作为病原体，机体可向肿瘤微环境募集nes，nes被激活并释放nets，进而促进肿瘤生长和转移(front immunol 11:1749.)。nets的生成过度或清除障碍是癌症转移的关键事件，因此减少肿瘤部位异常nets形成或增强nets降解是一种癌症治疗策略。
2、近年来，越来越多的研究显示nets可能是肿瘤治疗的一个新的重要靶点，但是正在进行的临床试验尚未明确抗-nets的最佳方式(curr pharm biotechnol19(15):1196-12
3、ccdc25作为癌细胞表面的跨膜蛋白，可以用抗体直接靶向阻断，但是抗体药物成本高昂，需多次给药。核酸药物有望成为继小分子化药和抗体药后的第三大类药物，具有高效低廉的优势。然而，核酸药物有效递送是核酸药物面临的一大难题，这是由于核酸带负电荷，亲水，不能直接穿透细胞膜，易被酶降解(j nanobiotechnology 20(1):279.)。
4、减毒沙门氏菌vnp20009是在鼠伤寒沙门氏菌基础上敲除毒性基因得到的，有治疗效果好、毒副作用低的优势，其本身也可以通过竞争营养、分泌毒素和引发宿主的免疫反应来破坏肿瘤组织，其在i期临床试验中已被证明是安全的(oncotarget 7(12):14940-14950；methods mol med 90:47-60；nature 291(5812):238-239.)。vnp20009作为典型的溶瘤菌，可以靶向肿瘤并侵染肿瘤细胞，在细胞内，vnp20009可以发生裂解，从而释放出细菌的内容物(theranostics 7(8):2250-2260.)。本专利技术希望借助于vnp20009，构建shccdc25核酸药物递送系统，将包载的核酸药物递送至肿瘤部位，来探索抗-nets治疗的新策略，最终达到靶向ccdc25基因进而抑制肿瘤转移的目的。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的问题，本专利技术的目的是提供一种携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌及其制备方法，可安全地应用于肿瘤治疗，抑制小鼠黑色素瘤的被动转移、小鼠乳腺癌的主动转移。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：第一方面，本申请提供一种携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌。
3、第二方面，本申请提供携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌的制备方法；
4、第三方面，本申请提供携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌在制备抗肿瘤药物中的应用。
5、本专利技术的一种携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌菌株，携带shccdc25干扰质粒以prna-u6.1为骨架进行改造，携带shccdc25干扰序列及其调控元件包含u6启动子和shccdc25，携带shccdc25干扰序列及其调控元件的核苷酸序列如seq idno.1所示，所述减毒沙门氏菌重组工程菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009衍生的重组工程菌株，所述衍生的重组工程菌株为基于vnp20009衍生或基因改造菌株，包括但不限于前述已经申请专利技术的各菌株(zl201410209851.7，zl201610946268.3，zl201610945015.4，zl201610945021.x，202010182038.0；acta pharmaceutica sinica b 2021，11(10):31653177；phop/phoq)，所携带shccdc25干扰质粒的重组工程菌株菌株。用携带prna-u6.1-nc质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009作为对照组。
6、进一步地，可定植于肿瘤乏氧区域并在侵染肿瘤细胞后，在肿瘤细胞内裂解释放出shccdc25并降低肿瘤细胞ccdc25水平，从而有效抑制小鼠黑色素瘤、乳腺癌等实体肿瘤的转移。
7、进一步地，尾静脉给药后，可抑制小鼠肿瘤肺转移灶组织中的ccdc25促转移信号通路，并抑制中性粒细胞胞外陷阱的形成。尾静脉给药后，携带shccdc25干扰质粒的vnp20009菌株在b16f10小鼠黑色素瘤被动肺转移模型和小鼠乳腺癌的主动转移模型中具有良好的生物安全性。
8、本专利技术携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌的制备方法，包括如下步骤：
9、(1)获得3种不同siccdc25的核苷酸序列，3种不同siccdc25的核苷酸序列包括siccdc25-1、siccdc25-2和siccdc25-3，所述siccdc25-1、siccdc25-2和siccdc25-3的核苷酸序列如seq id no.2-4所示；
10、(2)构建3种携带不同siccdc25的质粒：step 1设计同源重组引物；step2pcr得到dna片段；step 3将连接后产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌，其特征在于：携带shCCDC25干扰质粒以pRNA-U6.1为骨架进行改造，携带shCCDC25干扰序列及其调控元件包含U6启动子和shCCDC25，shCCDC25干扰序列及其调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述减毒沙门氏菌重组工程菌为基于减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009衍生或改造的携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌。
2.根据权利要求1所述的携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌菌株，其特征在于：可定植于肿瘤乏氧区域并在侵染肿瘤细胞后，裂解释放出shCCDC25并敲低肿瘤细胞CCDC25，从而有效抑制肿瘤细胞的转移，所述的肿瘤包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌等实体肿瘤。
3.根据权利要求1所述的携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌，其特征在于：尾静脉给药后可抑制小鼠肿瘤肺转移灶组织中的CCDC25促转移信号通路，并抑制中性粒细胞胞外陷阱的形成。
4.权利要求1所述的携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌
5.权利要求1所述的携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将B16F10或4T1细胞与携带或不携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌共孵育，裂解B16F10或4T1细胞，通过细胞涂板并计数来评估携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌的侵染肿瘤细胞特性。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌在肿瘤细胞中可裂解释放出shCCDC25并降低肿瘤细胞CCDC25水平。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：将B16F10或4T1细胞与携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌共孵育，通过qPCR检测B16F10或4T1细胞中CCDC25的表达水平来评估携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌的降低肿瘤细胞CCDC25的能力。
9.权利要求1所述的携带shCCDC25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌在制备抑制中性粒细胞胞外陷阱形成药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌，其特征在于：携带shccdc25干扰质粒以prna-u6.1为骨架进行改造，携带shccdc25干扰序列及其调控元件包含u6启动子和shccdc25，shccdc25干扰序列及其调控元件的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述减毒沙门氏菌重组工程菌为基于减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009衍生或改造的携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌。
2.根据权利要求1所述的携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌菌株，其特征在于：可定植于肿瘤乏氧区域并在侵染肿瘤细胞后，裂解释放出shccdc25并敲低肿瘤细胞ccdc25，从而有效抑制肿瘤细胞的转移，所述的肿瘤包括但不限于黑色素瘤、乳腺癌等实体肿瘤。
3.根据权利要求1所述的携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌，其特征在于：尾静脉给药后可抑制小鼠肿瘤肺转移灶组织中的ccdc25促转移信号通路，并抑制中性粒细胞胞外陷阱的形成。
4.权利要求1所述的携带shccdc25干扰质粒的减毒沙门氏菌重组工程菌的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，刘丽娜，陈晨，
申请(专利权)人：江苏靶标生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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