【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和基因工程，具体涉及一种高产睾酮分枝杆菌工程菌、及其制备方法和应用。
技术介绍
1、睾酮(testosterone，ts)又称睾固酮、睾甾酮或睾丸酮等，是主要的男性性激素，属于雄烷类类固醇，其分子结构包括酮基和羟基，分别位于第3位和第17位。在体内，这一激素由胆固醇通过一系列生理过程而生成，主要由睾丸中的细胞产生，但女性的卵巢和肾上腺组织也会产生少量的睾酮。其生物活性依赖于与雄激素受体的结合与激活，并在肝脏中最终转化为无活性代谢物，相较于其合成前体，ts缺少c-17脂肪侧链，属于c-19雄激素类。
2、睾酮在男性生殖组织如睾丸和前列腺的成熟、第二性征的形成(例如，体毛增长、骨量增加)、肌肉力量增加以及心理特性的塑造(例如攻击性、性驱动)上，其发挥着重要作用。它在男性和女性的整体健康、情感稳定、认知能力、新陈代谢及心血管系统健康等领域都起到了积极作用。当男性的睾酮水平低于标准范围，可能出现各种健康问题，如嗜睡、骨量减少和性功能障碍等症状。目前睾酮及其衍生物已经被fda批准治疗性腺功能减退症等疾病，具有显著的安全性和疗效。目前睾酮化学合成方式通常是以雄烯二酮(androst-4-ene-3,17-dione,4-ad)为底物，主要包括三个核心步骤：首先是对3位的羰基进行保护，然后对17位的羰基进行还原，接着进行3位的去保护和分离。这个合成方法条件相对严苛且步骤较多，伴随着较多的化工原料使用。
3、相比之下，通过微生物转化更具优势，因为具有更高的转化率和特异性，有效减少了化工原料使用，是化
4、而从较为廉价易得的植物甾醇出发，经“一锅法”催化生成睾酮可以有效降低生产成本，早在上个世纪，就有科研人员发现分枝杆菌转化谷甾醇和胆固醇的产物中存在17位羟基类固醇产物。2022年，tekucheva等人利用m.neoaurum vkm ac-1815d中实现了利用10g/l植物甾醇生成4.59g/l睾酮，摩尔转化率达到66％。虽然以上说明了新金色分枝杆菌这一底盘具有转化植物甾醇生成较高浓度睾酮的能力，但是上述研究的时空转化率较低，同时由于囿于较为不成熟的底盘菌，转化产物中具有例如ad(d)或者(1，)4-hbc等其他种类副产物，较多种类的副产物不利于工业化生产，仍有较大的优化空间。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种高产睾酮分枝杆菌工程菌、及其制备方法和应用的技术方案，从而解决现有技术分枝杆菌转化睾酮产量及纯度较低的问题。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术第一方面提供了一种高产睾酮分枝杆菌工程菌，该基因工程菌是在分枝杆菌的基因组上过表达了甾体17位羰基还原酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和nad(h)激酶。
4、进一步，该基因工程菌具体通过以下步骤得到：
5、1)利用分枝杆菌敲除质粒p2nil-sacb在kstd基因位点上，定向敲入强组成型启动子驱动的同源编码6-磷酸葡萄糖糖脱氢酶g6pdh基因片段；
6、2)利用分枝杆菌传统的attb位点整合载体pmv306过表达了来自酿酒酵母的甾体17位羰基还原酶17β-hsd；
7、3)利用分枝杆菌整合载体pml1358，在工程菌基因组中筛选并过表达辅酶ii供给的相关基因甲酸钙球菌的的nad(h)激酶mjnadk。
8、进一步，所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌或新金分枝杆菌，优选为能够降解甾醇生产甾药雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-1，4-二烯-3,17-二酮和/或9α-羟基-ad的分枝杆菌菌株，更优选为新金色分枝杆菌mycobacterium sp.nrrl b-3805。
9、本专利技术第二方面提供了一种高产睾酮分枝杆菌工程菌的制备方法，该方法为在新金色分枝杆菌mycobacterium sp.nrrl b-3805的基因组上过表达了甾体17位羰基还原酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和nad(h)激酶，具体包括以下步骤：
10、1)利用分枝杆菌敲除质粒p2nil-sacb在kstd基因位点上，定向敲入强组成型启动子驱动的同源编码6-磷酸葡萄糖糖脱氢酶g6pdh基因片段；
11、2)利用分枝杆菌传统的attb位点整合载体pmv306过表达了来自酿酒酵母的甾体17位羰基还原酶17β-hsd；
12、3)利用分枝杆菌整合载体pml1358，在工程菌基因组中筛选并过表达辅酶ii供给的相关基因甲酸钙球菌的的nad(h)激酶mjnadk。
13、本专利技术第三方面提供了上述的一种高产睾酮分枝杆菌工程菌在制备睾酮中的应用。
14、进一步，该应用利用所述的基因工程菌，以甾醇为发酵原料进行发酵以生产睾酮。
15、采用以上技术方案，本专利技术最终实现在10g/l植物甾醇底物浓度下，睾酮产量达到5.93g/l，时空产率为0.41g·l-1·d-1，副产物ad的浓度为至0.47g/l，是主产物ts浓度的7.9％，同时产物中不存在add和(1,)4-hbc等甾体副产物，显著提高了产物的纯度，降低了分离纯化的成本。随后通过测定发酵过程中工程菌胞内的辅酶ii含量，结果显示，应用该过表达体系，解除了胞内辅酶ii供给失衡的问题，有效提高了目标产物产量。
16、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术进一步完善了新金色分枝杆菌整合型过表达体系，成功以单拷贝的整合方式在新金色分枝杆菌基因组上实现无抗性标签的基因稳定高效表达，同时利用新型整合质粒pml1358过表达了辅酶ii的供给的相关基因，结合对工程菌胞内的辅酶nadp+和nadph浓度进行测定，有效解决了过表达甾体17位羰基还原酶17β-hsd工程菌中的辅酶ii失衡的问题，有效降低了副产物ad的浓度，提高了睾酮产量及其时空转化率。
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1.一种高产睾酮分枝杆菌工程菌，其特征在于，该基因工程菌是在分枝杆菌的基因组上过表达了甾体17位羰基还原酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和NAD(H)激酶。
2.如权利要求1所述的一种高产睾酮分枝杆菌工程菌，其特征在于，该基因工程菌具体通过以下步骤得到：
3.如权利要求1所述的一种高产睾酮分枝杆菌工程菌，其特征在于，所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌或新金分枝杆菌，优选为能够降解甾醇生产甾药雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮或9α-羟基-AD的分枝杆菌菌株，更优选为新金色分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805。
4.一种高产睾酮分枝杆菌工程菌的制备方法，其特征在于，在新金色分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRL B-3805的基因组上过表达了甾体17位羰基还原酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和NAD(H)激酶，具体包括以下步骤：
5.如权利要求1-3任一所述的一种高产睾酮分枝杆菌工程菌在制备睾酮中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于利用
...【技术特征摘要】
1.一种高产睾酮分枝杆菌工程菌，其特征在于，该基因工程菌是在分枝杆菌的基因组上过表达了甾体17位羰基还原酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶和nad(h)激酶。
2.如权利要求1所述的一种高产睾酮分枝杆菌工程菌，其特征在于，该基因工程菌具体通过以下步骤得到：
3.如权利要求1所述的一种高产睾酮分枝杆菌工程菌，其特征在于，所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌或新金分枝杆菌，优选为能够降解甾醇生产甾药雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮或9α-羟基-ad的分枝杆菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：柳志强，柯霞，崔家浩，王鑫鑫，曹国飞，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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