【技术实现步骤摘要】
本公开涉及生物，具体涉及一种去除非目标核酸模板的方法。
技术介绍
1、在pcr扩增过程中，pcr产物片段会通过气溶胶弥散在环境中，在进行第二次扩增实验，这些气溶胶的片段就会当成模板被扩增出来，最终会造成假阳性扩增的结果。
2、目前主要用来防止气溶胶污染的方法是dutp和udg酶(uracil dna glycosylase，尿嘧啶dna糖基酶)结合的方式，例如美国专利us7687247b1中公开的方法。但是，由于udg对du的切割，只是对一条链的切刻，在使用较低的dutp进行扩增产生的气溶胶，经过udg处理后仍然能被扩增出来。特别的是在tngs(targeted next generation sequencing，靶向下一代测序，例如病原微生物靶向测序)超多重pcr中，添加dutp的量不能太多，否则会影响多重扩增的性能，而添加较少的dutp会导致在tngs的多重扩增产物上du的比例较少，在udg进行切割之后的片段，会在扩增中通过正负链互搭的方式经过几轮pcr扩增会修复成一个完整的模板，从而导致气溶胶污染的模板被扩增出来。也就是说，udg酶并不能进行彻底清除含du的产物，增加udg酶的使用量仍然不能彻底清除。进而，我们在做tngs测序中，仍然能检测到来自气溶胶污染造成的假阳性的结果。因此当前的dutp结合udg酶的方法还不能真正地防止气溶胶污染。
技术实现思路
1、本公开的目的在于提供一种去除非目标核酸模板的方法，包括含有du/di/rx的引物介导的双链dna断裂法(简
2、本公开的第一方面提供一种去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：向包含目标核酸模板和非目标核酸模板的反应体系中加入消化酶组合，并孵育；所述消化酶组合包括dna糖基化酶和ap位点内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有du(脱氧尿苷)或di(脱氧肌苷)中的至少一种，所述目标模板中不含有du或di；
3、或者，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有ra(腺嘌呤核糖核苷)，ru(尿嘧啶核糖核苷)，rg(鸟嘌呤核糖核苷)，rc(胞嘧啶核糖核苷)中的至少一种，所述目标核酸模板中不含有ra，ru，rg和rc。
4、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中仅含有di时，所述目标模板中不含有di，但可以含有或不含有du；当所述非目标核酸模板中仅含有du时，所述目标模板中不含有di，但可以含有或不含有di；当所述非目标核酸模板中仅含有du和di时，所述目标模板中不含有du或di。
5、在一些实施方案中，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，或，所述消化酶组合包括dna糖基化酶、ap位点内切酶、缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶。
6、在一些实施方案中，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶和缺刻位点识别的内切酶，或，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶，或，所述消化酶组合包括核糖核酸内切酶、缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶。
7、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板包含双链核酸。在一些实施方案中，所述非目标核酸模板包含双链dna，所述双链dna至少部分互补。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链含有du或di，或，所述双链dna中至少一条链含有ra、ru、rg和rc中的至少一种。在一些实施方案中，所述双链dna中至少一条链的引物匹配位置含有du或di，或，所述双链dna中至少一条链的的引物匹配位置含有ra、ru、rg和rc中的至少一种。
8、在一些实施方案中，所述非目标核酸模板来自环境，例如气溶胶。
9、在一些实施方案中，所述反应体系是例如pcr扩增体系或等温扩增体系。
10、在一些实施方案中，所述dna糖基化酶特异性识别双链dna上的du或di位点并产生无嘌呤/无嘧啶位点(即ap位点)。
11、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(uracil dnaglycosylase，udg酶)或单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶(single-strand selective monofunctional uracil-dnaglycosylase，smug酶)，所述udg酶或smug酶特异性识别du位点并切除尿嘧啶(uracil，du)从而产生无嘧啶位点。
12、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(alkyladenine dna glycosylase，aag酶)或者内切酶ⅴ(endonuclease v)，所述aag酶或者内切酶ⅴ特异性识别di位点并切除次黄嘌呤(hypoxanthine，di)从而产生无嘌呤位点。
13、在一些实施方案中，当所述非目标核酸模板中含有du和di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶可以是分别识别du和di位点的两种酶，包括但不限于前述列举的dna糖基化酶的任意排列组合，例如udg酶和aag酶。
14、在一些实施方案中，ap位点是指无嘌呤/无嘧啶位点，缺刻位点是指损伤的核酸链上断裂一个磷酸二酯键，缺口是指损伤的核酸链上丢失一个或几个核苷酸而出现的一段缺口。
15、在一些实施方案中，所述ap位点内切酶可以识别ap位点并进行切除磷酸二酯键，形成缺刻或1个碱基的缺口。所述ap位点内切酶是例如ape1(人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶，apurinic-apyrimidinic endonuclease 1)，内切酶iii(endonuclease iii)，内切酶iv(endonuclease iv)，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶，formamidopyrimidine[fapy]-dna glycosylase)，内切酶v(endonuclease v)，内切酶viii(endonuclease viii)，ogg1(8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶1，8-oxo guanine dna glycosylase 1)，t4 pdg(t4嘧啶二聚体糖基化酶，t4 pyrimidine dna glycosylase)，h本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：向包含目标核酸模板和非目标核酸模板的反应体系中加入消化酶组合，并孵育；所述消化酶组合包括DNA糖基化酶和AP位点内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有dU(脱氧尿苷)或dI(脱氧肌苷)中的至少一种，所述目标模板中不含有dU或dI；
2.一种PCR扩增中去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：
3.一种PCR扩增中去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述非目标核酸模板包含双链DNA，所述双链DNA至少部分互补。
5.根据权利要求1-2任一项所述的方法，当所述非目标核酸模板中含有dU时，所述消化酶组合中的DNA糖基化酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG酶)或单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖基化酶(SMUG酶)；当所述非目标核酸模板中含有dI时，所述消化酶组合中的DNA糖基化酶是烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(AAG酶)或者内切酶Ⅴ。
6.根据权利要求1-2任一项所述的方法，
7.根据权利要求1、权利要求3所述的方法，所述核糖核酸内切酶是RNase H和RNaseHII中的至少一种。
8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述缺刻位点识别的内切酶是T7内切酶I和错配内切酶I(Mismatch Endonuclease I)中的至少一种。
9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是λ核酸外切酶。
10.根据权利要求2-3任一项所述的方法，所述引物中修饰位点在所述引物3'末端的第1-8个核苷酸，所述修饰位点有1-8个。
11.根据权利要求2所述的方法，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，优选30-38℃处理5-15分钟，更优选35-37℃处理5-15分钟，更优选35-37℃处理5-10分钟，更优选37℃处理5-10分钟，更优选37℃处理8-10分钟，最优选37℃处理10分钟。
12.根据权利要求2所述的方法，所述目标核酸模板是DNA模板；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少1U的DNA糖基化酶、5U的AP位点内切酶和1U的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少2U的DNA糖基化酶、5U的AP位点内切酶和2.5U的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少1U的SMUG酶，5U的内切酶IV和2.5U的错配内切酶I；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少1U的UDG酶，5U的APE1酶和2.5U的T7内切酶I；
13.根据权利要求3所述的方法，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，优选30-38℃处理10-20分钟，更优选32-37℃处理10-20分钟，更优选35-37℃处理15-20分钟，更优选35-37℃处理15-20分钟，更优选37℃处理15-20分钟，更优选37℃处理18-20分钟，最优选37℃处理20分钟。
14.根据权利要求3所述的方法，所述目标核酸模板是DNA模板；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少2.5U的核糖核酸内切酶和2.5U的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少5U的核糖核酸内切酶和5U的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少2.5U的RNase HⅡ和2.5U的T7内切酶Ⅰ；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngDNA模板使用至少5U的RNase HⅡ和5U的T7内切酶Ⅰ。
15.根据权利要求2-3任一项所述的方法，所述步骤(3)的扩增反应包括变性、退火和延伸，优选95℃高温变性。
16.根据权利要求2-3任一项所述的方法，所述DNA聚合酶是耐热DNA聚合酶，优选TaqDNA聚合酶；所述引物包含至少一对上游引物和下游引物；所述金属盐包括Mg2+盐、K+盐、Mn2+盐、Na+盐、Co2+盐和Ca2+盐中...
【技术特征摘要】
1.一种去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：向包含目标核酸模板和非目标核酸模板的反应体系中加入消化酶组合，并孵育；所述消化酶组合包括dna糖基化酶和ap位点内切酶，以及缺刻位点识别的内切酶和5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶中的至少一种；所述非目标核酸模板中含有du(脱氧尿苷)或di(脱氧肌苷)中的至少一种，所述目标模板中不含有du或di；
2.一种pcr扩增中去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：
3.一种pcr扩增中去除非目标核酸模板的方法，所述方法包括：
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述非目标核酸模板包含双链dna，所述双链dna至少部分互补。
5.根据权利要求1-2任一项所述的方法，当所述非目标核酸模板中含有du时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(udg酶)或单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶(smug酶)；当所述非目标核酸模板中含有di时，所述消化酶组合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(aag酶)或者内切酶ⅴ。
6.根据权利要求1-2任一项所述的方法，所述ap位点内切酶是ape1(人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1)，内切酶iii，内切酶iv，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶)，内切酶v，内切酶viii，ogg1(8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶1)，t4 pdg(t4嘧啶二聚体糖基化酶)，hneil1(human endonuclease viii-like 1)和hnthl1(human nth like dnaglycosylase 1)中的至少一种。
7.根据权利要求1、权利要求3所述的方法，所述核糖核酸内切酶是rnase h和rnasehii中的至少一种。
8.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述缺刻位点识别的内切酶是t7内切酶i和错配内切酶i(mismatch endonuclease i)中的至少一种。
9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述5'磷酸基团依赖的5'-3'核酸外切酶是λ核酸外切酶。
10.根据权利要求2-3任一项所述的方法，所述引物中修饰位点在所述引物3'末端的第1-8个核苷酸，所述修饰位点有1-8个。
11.根据权利要求2所述的方法，所述孵育条件是30-40℃处理5-20分钟，优选30-38℃处理5-15分钟，更优选35-37℃处理5-15分钟，更优选35-37℃处理5-10分钟，更优选37℃处理5-10分钟，更优选37℃处理8-10分钟，最优选37℃处理10分钟。
12.根据权利要求2所述的方法，所述目标核酸模板是dna模板；优选地，所述消化酶组合的使用量为每ngdna模板使用至少1u的dna糖基化酶、5u的ap位点内切酶和1u的缺刻位点识别的内切酶；优选地，所述消化...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭佳银，江明扬，聂俊伟，瞿志鹏，曹林，吴恒，王慧琪，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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