【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体及其应用，属于酶工程。背景研究黄原胶是由野油菜黄单胞杆菌分泌的一种胞外杂多糖，其结构特点：具有像纤维素一样的复杂结构，由五糖单元重复构成，主链由以β-1，4糖苷键相连的葡萄糖构成，侧链三糖通过α-(1,3)-糖苷键连接到主链葡萄糖单位上，侧链三糖由β-甘露糖-(1,4)β-葡萄糖醛酸-(1,2)α-甘露糖构成。钻井液黄原胶：是一种高效、优质、环保的石油钻石泥浆添加剂。钻井液黄原胶的作用是：提高钻井效率，减少井壁崩塌，稳定井壁，防止漏失和污染。黄原胶特殊的结构赋予了它较高的粘度特性。它的优点得益于它的高粘度，但它的高粘度也使得在采油工业中原油乳化状态复杂，增加了后续工艺如油料运输及产品纯化的成本。所以唯有做到可方便地将使用后的黄原胶降解，使它的粘度降低，才可使得对黄原胶的应用做到"进可攻，退可守"。目前，降解黄原胶的方法有物理法(高温、射线、超声等)、化学法(酸解，碱解)和生物法(酶解)。而鉴于物理法，成本高，反应条件需要优化，易形成有色物质；化学法获得寡糖会伴随有毒物质的产生，酸、碱、强氧化剂的反应剧烈，监测困难；酶法降解黄原胶一般是通过菌体破碎后粗酶液直接进行，产物为大小不等，分布并不均一的寡糖。但在实际应用中，大多数钻井液的ph值要求控制在8～11之间，即维持一个碱性环境，而碱性环境不利于维持酶活。因此探究黄原胶降解酶的耐碱性机制，提高其耐碱性，实现酶法降解钻井液黄原胶的工业应用具有重要意义。
技术介绍
技术实现思路
1、针对
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案，
3、一种耐碱性提高的纤维素内切酶cel12e突变体，所述耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体的氨基酸序列是在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上发生如下一种或多种氨基酸定点突变：s126v、r200i、s216v、t273v。
4、所述seq id no:2所示氨基酸序列为深海喷口超嗜热古菌(hyperthermophilicarchaea from deep sea vents)野生型耐热纤维素内切酶cel12e的氨基酸序列，耐热纤维素内切酶cel12e的基因序列来源于文献(benedikt l,simon h,angel a,etal.functional screening of hydrolytic activities reveals an extremelythermostable cellulase from a deep-sea archaeon[j].frontiers inbioengineering and biotechnology,2015,3.)。
5、进一步地，所述耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体的氨基酸序列是在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上发生如下氨基酸定点突变：s126v、r200i、s216v、t273v或r200i&t273v。
6、在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上将第126位的丝氨酸突变为缬氨酸，获得耐热纤维素内切酶cel12e(s126v)突变体，其氨基酸序列如seq id no:3所示；
7、在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上将第200位的精氨酸突变为异亮氨酸，获得耐热纤维素内切酶cel12e(r200i)突变体，其氨基酸序列如seq id no:4所示；
8、在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上将第216位的丝氨酸突变为缬氨酸，获得耐热纤维素内切酶cel12e(s216v)突变体，其氨基酸序列如seq id no:5所示；
9、在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上将第273位的苏氨酸突变为缬氨酸，获得耐热纤维素内切酶cel12e(t273v)突变体，其氨基酸序列如seq id no:6所示；
10、在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上将第200位的精氨酸突变为异亮氨酸，同时，将第273位的苏氨酸突变为缬氨酸，获得耐热纤维素内切酶cel12e(r200i&t273v)突变体，其氨基酸序列如seq id no:7所示。
11、本专利技术还提供编码耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体的基因，编码所述的耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体的基因均是对seq id no:1所示的核苷酸序列进行定点突变获得。
12、进一步地，seq id no:1所示的核苷酸序列为编码野生型耐热纤维素内切酶cel12e氨基酸序列的核苷酸序列。
13、本专利技术还提供一种上述耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体的应用，所述的耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体可应用于碱性条件下黄原胶的降解。
14、进一步地，所述的耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体可应用于ph8～11的钻井液中黄原胶的降解。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术提供了一种耐热纤维素酶cel12e在碱性条件下稳定性显著提高的突变体。突变后的酶在ph＝8条件下的纯酶酶活分别是野生酶的116.2％、129.9％、125.7％、150.6％，r200i&t273v的组合突变体提高了159.3％。本专利技术公布了突变后耐碱性显著提高的纤维素酶，该酶可以降解黄原胶，使得黄原胶在高温和碱性条件下更有效的降解，为钻井液黄原胶的工业应用建立起夯实的基础。
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1.一种耐碱性提高的耐热纤维素内切酶Cel12E突变体，其特征在于，所述耐碱性提高的耐热纤维素内切酶Cel12E突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的基础上发生如下一种或多种氨基酸定点突变：S126V、R200I、S216V、T273V。
2.根据权利要求1所述的耐碱性提高的耐热纤维素内切酶Cel12E突变体，其特征在于，所述耐碱性提高的耐热纤维素内切酶Cel12E突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的基础上发生如下氨基酸定点突变：S126V、R200I、S216V、T273V或R200I&T273V。
3.一种编码权利要求1或2所述的耐碱性提高的耐热纤维素内切酶Cel12E突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述的耐碱性提高的耐热纤维素内切酶Cel12E突变体的基因均是对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行定点突变获得。
5.一种权利要求1-2任一所述的耐碱性提高的
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，耐碱性提高的耐热纤维素内切酶Cel12E突变体可应用于pH8～11的钻井液中黄原胶的降解。
...【技术特征摘要】
1.一种耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体，其特征在于，所述耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体的氨基酸序列是在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上发生如下一种或多种氨基酸定点突变：s126v、r200i、s216v、t273v。
2.根据权利要求1所述的耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体，其特征在于，所述耐碱性提高的耐热纤维素内切酶cel12e突变体的氨基酸序列是在seq id no:2所示氨基酸序列的基础上发生如下氨基酸定点突变：s126v、r200i、s216v、t273v或r200i&t273v。
3.一种编码权利要求1或2所述的耐碱性提高的耐热纤...
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