【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别是涉及牛冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用。
技术介绍
1、牛冠状病毒（bovine coronavirus，bcov）为有囊膜病毒，是不分节段的单股正链rna病毒。bcov属于套式病毒目（ nidovirales），冠状病毒科（ coronaviridae），冠状病毒属（ coronavirus）2a亚群成员。bcov病毒粒子具有多形性，大多数病毒粒子直径在65 ~ 210nm之间，基因组全长约31 kb，编码10个开放阅读框（open reading frames, orfs），其中，orf3、orf4、orf8、orf9和orf10分别编码血凝素酯酶蛋白（hemagglutinin protein，he）、刺突糖蛋白（spike protein，s）、包膜蛋白（envelope protein，e）、膜蛋白（membraneprotein，m）和核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，n），这五种蛋白共同组成了bcov的主要结构蛋白。
2、牛冠状病毒病是由bcov所引起的导致牛呼吸道和肠道感染的病毒性疾病。bcov被广泛认为是引起初生犊牛腹泻（calf diarrhea, cd）的重要病原之一，此外，还会导致成年牛冬痢疾和呼吸道相关症状，是具有肠、肺双嗜性的病毒。
3、bcov特殊的形态结构导致了该病毒分离困难，近年来我国bcov广泛流行，牛场中的bcov总
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供牛冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用。
2、第一方面，本专利技术提供一种牛冠状病毒结构蛋白基因，包括以下蛋白中的至少一种：e基因、m基因、n基因、s基因和he基因；
3、所述e基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
4、所述m基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；
5、所述n基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；
6、所述s基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；
7、所述he基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
8、在本专利技术的一些实施例中，将所述e基因、m基因、n基因、he基因中的至少一种进行扩增，所述扩增时，e基因的核苷酸序列的正向引物如seq id no.6所示，反向引物序列如seq id no.7所示；
9、m基因的核苷酸序列的正向引物序列如seq id no.8所示；反向引物序列如seq idno.9所示；
10、n基因的核苷酸序列的正向引物序列如seq id no.10所示；反向引物序列如seqid no.11所示；
11、he基因的核苷酸序列的正向引物序列如seq id no.12所示；反向引物序列如seqid no.13所示。
12、第二方面，本专利技术提供一种重组质粒，其包括前述牛冠状病毒结构蛋白基因。
13、第三方面，本专利技术提供一种重组杆粒，其包括前述重组质粒。
14、第四方面，本专利技术提供一种重组杆状病毒，其包括前述的重组杆粒。
15、第五方面，本专利技术提供一种牛冠状病毒病毒样颗粒，其由前述牛冠状病毒结构蛋白装配而成。
16、第六方面，本专利技术提供一种牛冠状病毒病毒样颗粒的制备方法，包括：
17、（1）设计并扩增牛冠状病毒结构蛋白基因；
18、（2）构建重组质粒；
19、（3）构建重组杆粒；
20、（4）将（3）中的重组杆粒转染细胞，得到重组杆状病毒；
21、（5）将重组杆状病毒共感染细胞，得到牛冠状病毒病毒样颗粒。
22、第七方面，本专利技术提供一种免疫原，其包括前述的牛冠状病毒结构蛋白。
23、第八方面，本专利技术提供一种药物组合物，包括：前述的牛冠状病毒结构蛋白。
24、所述药物组合物还可以包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。
25、辅料是指生产药物组合物和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能，以使药物组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请的药物组合物共同施用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。
26、第九方面，本专利技术提供了一种前述的牛冠状病毒结构蛋白基因在制备用于治疗和/或预防牛冠状病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。
27、本专利技术具有如下有益效果：
28、（1）本专利技术表达出牛冠状病毒的完整e、m、n、s、he五种主要结构蛋白，并使五种主要结构蛋白完成自组装，构建出形态和大小与天然bcov病毒粒子极其类似的bcov vlps；
29、（2）本专利技术中，以balb/c小鼠、sd大鼠、荷斯坦犊牛为实验动物，设计了免疫方案并进行了免疫原性评估，结果显示：balb/c小鼠血清最高elisa特异性igg抗体效价达到1:1.28×104，中和效价达到1:128；荷斯坦犊牛血清最高elisa特异性igg抗体效价达到1:1.024×105，中和效价达到1:512；
30、（3）本专利技术将bcov vlps与mf59佐剂、cpg 55.2混合制备成疫苗，免疫后能够使balb/c小鼠与荷斯坦犊牛体内产生体液和细胞免疫应答，此外，该疫苗还对攻毒bcov后的sd乳鼠起到了显著降低肺脏与肠道bcov病毒载量的作用，说明bcov vlps有望成为新型bcov候选疫苗。
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1.一种牛冠状病毒结构蛋白基因，其特征在于，其包括以下蛋白中的至少一种：E基因、M基因、N基因、S基因和HE基因；
2.根据权利要求1所述的牛冠状病毒结构蛋白基因，其特征在于，将所述E基因、M基因、N基因、HE基因中的至少一种进行扩增；所述扩增时，E基因的核苷酸序列的正向引物如SEQID NO.6所示，反向引物序列如SEQ ID NO.7所示；
3.一种重组质粒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的牛冠状病毒结构蛋白基因。
4.一种重组杆粒，其特征在于，其包括权利要求3所述的重组质粒。
5.一种重组杆状病毒，其特征在于，其包括权利要求4所述的重组杆粒。
6.一种牛冠状病毒病毒样颗粒，其特征在于，其由权利要求1或2所述的牛冠状病毒结构蛋白装配而成。
7.一种牛冠状病毒病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括：
8.一种免疫原，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的牛冠状病毒结构蛋白基因。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的牛冠状病毒结构蛋白基因。
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...【技术特征摘要】
1.一种牛冠状病毒结构蛋白基因，其特征在于，其包括以下蛋白中的至少一种：e基因、m基因、n基因、s基因和he基因；
2.根据权利要求1所述的牛冠状病毒结构蛋白基因，其特征在于，将所述e基因、m基因、n基因、he基因中的至少一种进行扩增；所述扩增时，e基因的核苷酸序列的正向引物如seqid no.6所示，反向引物序列如seq id no.7所示；
3.一种重组质粒，其特征在于，其包括权利要求1或2所述的牛冠状病毒结构蛋白基因。
4.一种重组杆粒，其特征在于，其包括权利要求3所述的重组质粒。
5.一种重...
【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，喻琦胜，汤承，岳华，高立，陈曦，王远微，
申请(专利权)人：西南民族大学，
类型：发明
国别省市：
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