【技术实现步骤摘要】
本文描述的为基因工程化的霍乱弧菌(vibrio cholerae)细菌，包括该细菌的药物组合物，以及使用该细菌和/或包括该细菌的药物组合物通过快速益生菌保护(probiotic protection)并且诱导适应性免疫应答的组合来预防由霍乱弧菌的毒力菌株引起的疾病的方法。序列表本申请包含序列表，该序列表已经以ascii格式电子提交，并通过引用整体并入本文。所述ascii副本创建于2018年7月10日，命名为29618-0175wo1_sl.txt，并且大小为5.03兆字节。
技术介绍
1、霍乱是由革兰氏阴性菌霍乱弧菌(vibrio cholerae)感染引起的腹泻病。该疾病可以是迅速致命的，而且疫情往往呈爆发性传播。抵抗疾病的努力包括口服补液和抗生素治疗。然而，该疾病是发展中国家和不稳定国家中的主要公共健康危害(参见，例如，bohles等人(2014)hum.vaccin.immunother.10(6)：1522-35)。目前正在开展疫苗接种活动，部署包含已灭活的霍乱弧菌细菌菌株的疫苗。但是，利用这些疫苗减少正在进行的流行病的扩散(所谓的“反应性疫苗接种”)取决于疫苗接种受试者对霍乱产生抵抗力所需的时间。当前疫苗引发的保护性免疫应答通常需要数天或数周才能显现出来，并且通常需要多重疫苗剂量。因此，需要可以在单剂量后诱导针对霍乱弧菌的快速保护的疫苗。
技术实现思路
1、本文描述的为减毒霍乱弧菌细菌菌株，其以前所未有的方式作为益生菌剂，以快速预防霍乱，并作为传统疫苗，以引发在现有霍乱疫
2、此外，减毒霍乱弧菌细菌菌株可以通过重新获得毒力基因(virulence gene)以诱导逆转为毒力菌株(virulent strain)，并且还提供了防止和/或减轻haitiv转化为产毒性的可能性的方法。特别令人担忧的是编码作为病原体的主要腹泻因子的霍乱毒素的基因，其从活霍乱疫苗中缺失。水平基因转移的任何方法，包括通过编码霍乱毒素的噬菌体(ctxφ)的再感染或自然转化，都足以诱导疫苗转化。申请人已经开发了减毒霍乱弧菌细菌菌株，其被修饰以包括能够特异性靶向ctxa基因的rna指导的核酸内切酶系统，所述ctxa基因编码霍乱毒素的活性亚基。该策略提供了一种生物安全机制，通过包括由ctxφ噬菌体感染的任何方式防止霍乱弧菌细菌重新获得ctxa。此外，该策略可通过对菌株进行工程化以从质粒编码的或染色体整合的构建体中产生抗毒力因子(anti-virulence factor)crispr系统，推广到其他减毒疫苗株(例如vaxchora和peru-15)中。
3、一方面，本专利技术提供一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其在编码霍乱毒素亚基a的核酸序列中具有缺失；编码cas9核酸酶分子的异源核酸序列；和编码指导rna(grna)的异源核酸序列，其中所述grna包含与ctxa的靶核酸序列互补的靶向结构域。
4、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码霍乱毒素亚基a的核酸序列中具有缺失，所述缺失位于整合至细菌基因组的ctxa基因中。
5、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在整合至细菌基因组中的ctxφ基因组的核心区域的核酸序列中具有缺失。
6、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在整合至细菌基因组中的ctxφ基因组的rs2区的核酸序列中具有缺失。
7、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌在整合至细菌基因组的ctxφ基因组中具有完全缺失。
8、在另一方面，本公开提供一种基因工程化的霍乱弧菌，其具有编码cas9核酸酶分子的异源核酸序列；和编码指导rna(grna)的异源核酸序列，其中所述grna包含与ctxφ的靶核酸序列互补的靶向结构域。
9、在一些实施方案中，ctxφ基因组的靶核酸序列位于选自由以下组成的组的基因中：rstr、rsta、rstb、psh、cep、orfu、ace、zot、ctxa和ctxb。在一些实施方案中，ctxφ基因组的靶核酸序列位于ctxa基因中。在一些实施方案中，所述grna包含核酸序列5＇-cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3＇(seq id no：3)，或由其组成。
10、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌先前没有整合至细菌基因组中的ctxφ基因组的拷贝。
11、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码多功能自加工毒素重复序列(multifunctional-autoprocessing repeats-in-toxin，martx)毒素的核酸序列中具有缺失。在一些实施方案中，编码martx毒素的核酸序列选自由以下组成的组：rtxa、rtxb、rtxc、rtxd和rtxe。
12、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码dna结合蛋白hu-β的核酸序列中具有缺失。在一些实施方案中，编码dna结合蛋白hu-β的核酸序列是hupb基因。
13、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码鞭毛蛋白的核酸中具有缺失。在一些实施方案中，编码鞭毛蛋白的核酸序列选自由以下组成的组：flaa、flab、flac、flad和flae。
14、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌包含异源核酸，其中所述异源核酸包含可操作地连接至启动子的编码霍乱毒素亚基b的基因。在一些实施方案中，编码霍乱毒素亚基b的基因是ctxb基因。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子是phtpg启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子。
15、在一些实施方案中，本文提供的基因工程化的霍乱弧菌细菌在编码reca蛋白的核酸序列中具有缺失。在一些实施方案中，编码reca蛋白的核酸序列是reca基因。
16、在另一方面，本专利技术提供一种基因工程化的霍乱本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其包含：
2.根据权利要求1所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述编码霍乱毒素亚基A的核酸序列中的缺失位于整合至所述细菌的基因组中的ctxA基因中。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的CTXΦ基因组的核心区域的核酸序列中的缺失。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的CTXΦ基因组的RS2区域的核酸序列中的缺失。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的CTXΦ基因组的完全缺失。
6.一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其包含：
7.根据权利要求6所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌先前未包含整合至细菌基因组中的CTXΦ基因组的拷贝。
8.根据权利要求6或7所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述CTXΦ基因组的靶核酸序列位于选自由以下组成的组的基因中：rstR、rstA
9.根据权利要求6-8中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述CTXΦ基因组的靶核酸序列位于ctx4基因中。
10.根据权利要求9所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述gRNA包含核酸序列5’-cctgatgaaataaagcagtcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’(SEQ ID NO：3)。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其包含：
2.根据权利要求1所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述编码霍乱毒素亚基a的核酸序列中的缺失位于整合至所述细菌的基因组中的ctxa基因中。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的ctxφ基因组的核心区域的核酸序列中的缺失。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的ctxφ基因组的rs2区域的核酸序列中的缺失。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的基因工程化的霍乱弧菌细菌，其中所述细菌包含整合至所述细菌的基因组中的ctxφ基因组的完全缺失。
6.一种基因工程化的霍乱弧菌细菌，其包含：
7.根据权利要求6所述的基因工程化...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·K·沃尔多，T·哈巴德，G·比林斯，
申请(专利权)人：布里格姆妇女医院，
类型：发明
国别省市：
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