【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物疫苗与兽用生物制品，特别涉及一种鸭瘟病毒的亚单位gd及其制备方法和应用。
技术介绍
1、鸭瘟又称鸭病毒性肠炎，是由鸭瘟病毒(duck plague virus,dpv)引起的一种急性、败血性传染病。主要造成鸭、鹅和其他雁形目禽类动物发生血管损伤、组织出血、消化道黏膜糜烂、淋巴器官受损和全身实质性器官退行性病变。该病最早于1923年在荷兰首次发现，我国在1959年在广东省首次报道。目前，鸭瘟已成为水禽养殖业危害最严重的疫病之一，造成巨大经济损失，严重影响水禽养殖业的发展。
2、目前对该病尚无有效的治疗手段，主要依靠疫苗进行防控。目前主要是通过弱毒疫苗和灭活疫苗预防该病发生。然而常规弱毒疫苗在大面积使用过程中，有可能与同源的强毒株发生重组，毒力变强或出现新型毒株，造成免疫失败，甚至导致新的疫情发生。而灭活疫苗存在剂量大、不能区分免疫群体和感染群体，不利于净化，因此需要。
3、dpv属疱疹病毒科马立克氏病毒属成员，目前对dpv病原分子生物学研究相对落后。随着研究的深入，dpv病毒基因及其产物逐渐被鉴定出来。和其他疱疹病毒类似，dpv基因组为双股线状dna，表面编码gb，gc，gd，ge等多个蛋白。其中gd蛋白是病毒囊膜的主要蛋白，参与病毒与细胞受体结合，能够刺激机体产生中和抗体，是亚单位疫苗的首先糖蛋白。亚单位疫苗不含有核酸物质，接种后不会产生持续感染或潜伏感染；产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。但是亚单位疫苗也有明显的缺陷：生产成本高，应用受到限制。
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5、然而，在使用工程化细胞表达蛋白时，如何表达出折叠正确蛋白及可规模化生产关键在于氨基酸的选择和设计上。目前，尚无在哺乳动物细胞上规模化表达鸭瘟病毒重组gd蛋白的报道。因此，本专利技术通过对gd蛋白的结构序列进行分析和优化，提供了一种重组表达制备鸭瘟病毒gd蛋白的技术方法，为鸭瘟病毒的预防和诊断提供基础。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的第一个目的在于提供一种鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白，其亚单位gd蛋白具有鸭瘟病毒gd蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在工程化细胞株中稳定高效的分泌表达。
2、本专利技术的第二个目的在于提供一种鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白的制备方法，便于亚单位gd蛋白的大规模生产，降低了亚单位gd蛋白的生产成本。
3、本专利技术的第三个目的在于提供一种鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白的应用，其能够较好的适用于鸭瘟病毒的亚单位疫苗和诊断试剂中，从而便于人们对鸭瘟病毒的防控。
4、为实现上述第一个目的，本专利技术提供了如下技术方案：
5、一种鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白，所述亚单位gd蛋白为鸭瘟病毒gd蛋白截短的胞外区蛋白，所述亚单位gd蛋白的氨基酸序列为：
6、①如seq id no.1所示的氨基酸序列；
7、②由seq id no.1经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的具有免疫原性的衍生的氨基酸序列。
8、根据本专利技术的技术方案，优先地，在如seq id no.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-his、flag、c-myc、ha和poly-arg中的一种标签。
9、根据本专利技术的技术方案，优先地，所述亚单位gd蛋白的编码基因序列如seq idno.2所示，或由seq id no.2经密码子优化后所得的亚单位gd蛋白。
10、根据本专利技术的技术方案，优先地，所述密码子优化后所得的亚单位gd蛋白的编码基因序列如seq id no.3所示。
11、为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：
12、一种鸭瘟病毒gd蛋白的制备方法，包括以下步骤：
13、①、构建鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白的编码基因序列；
14、②、将所述亚单位gd蛋白的编码基因序列克隆到真核表达载体中，得到含有亚单位gd蛋白编码基因序列的重组质粒；
15、③、将所述含有亚单位gd蛋白编码基因序列的重组质粒转染至动物的工程化细胞中，得到细胞株；
16、④、从步骤③得到的所述细胞株中筛选出高度表达的细胞株；
17、⑤、发酵培养步骤④中得到的所述高度表达的细胞株，纯化后得到鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白。
18、本专利技术的技术方案中，优选地，步骤②中，所述真核表达载体为pee6.4、pee12.4、pgl4.13和pcdna3.1中的一种。
19、本专利技术的技术方案中，更优选地，步骤②中，所述真核表达载体为pee12.4。
20、本专利技术的技术方案中，优选地，步骤③中，所述细胞株为cho细胞株、hek293细胞株和293t/17细胞株的一种。
21、本专利技术的技术方案中，优选地，步骤③中，所述cho细胞株为dg44细胞株、dxb11细胞株、cho-k1细胞株和cho-s细胞株的一种。
22、为实现上述第二个目的，本专利技术提供了如下技术方案：
23、一种鸭瘟病毒亚单位gd蛋白的应用，所述亚单位gd蛋白适用于鸭瘟病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中。
24、综上所述，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一种亚单位gd蛋白，具有鸭瘟病毒gd蛋白优良的免疫原性和稳定性，同时便于在工程化细胞株中稳定高效的分泌表达，其产量高且易于纯化，在细胞培养上清中的目的蛋白纯度都能达到80％以上，只需一步亲和层析就能使目的蛋白纯度达到90％以上，远远满足亚单位疫苗和诊断试剂的需求，以便于大规模生产，由此解决了鸭瘟病毒gd蛋白生产成本高的技术问题。另外，由于生产用的cho细胞株、hek293细胞株、293t/17细胞株等工程化细胞株在培养时可控制性高、质控容易、生产蛋白批次间稳定，因此本专利技术生产的鸭瘟病毒亚单位gd蛋白中其他病毒量少，有效降低了散毒的风险，具有优异的生物安全性。
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1.一种鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白，其特征在于，所述亚单位gD蛋白为鸭瘟病毒gD蛋白截短的胞外区蛋白，所述亚单位gD蛋白的氨基酸序列为：
2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白，其特征在于，在如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-His、FLAG、c-myc、HA和poly-Arg中的一种标签。
3.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白，其特征在于，所述亚单位gD蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2经密码子优化后所得的亚单位gD蛋白。
4.根据权利要求3所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白，其特征在于，所述密码子优化后所得的亚单位gD蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述真核表达载体为pEE6.4、pEE12.4、pCAGGS、pGL4
7.根据权利要求6所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述真核表达载体为pEE12.4。
8.根据权利要求5所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述细胞株为CHO细胞株、HEK293细胞株、293T/17细胞株的一种。
9.根据权利要求8所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述CHO细胞株为DG44细胞株、DXB11细胞株、CHO-K1细胞株和CHO-S细胞株的一种。
10.权利要求1-4中任意一项所述的鸭瘟病毒的亚单位gD蛋白的应用，其特征在于，所述亚单位gD蛋白适用于鸭瘟病毒的亚单位疫苗或诊断试剂中。
...【技术特征摘要】
1.一种鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白，其特征在于，所述亚单位gd蛋白为鸭瘟病毒gd蛋白截短的胞外区蛋白，所述亚单位gd蛋白的氨基酸序列为：
2.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白，其特征在于，在如seq id no.1所示的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端连接有poly-his、flag、c-myc、ha和poly-arg中的一种标签。
3.根据权利要求1所述的鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白，其特征在于，所述亚单位gd蛋白的编码基因序列如seq id no.2所示，或由seq id no.2经密码子优化后所得的亚单位gd蛋白。
4.根据权利要求3所述的鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白，其特征在于，所述密码子优化后所得的亚单位gd蛋白的编码基因序列如seq id no.3所示。
5.一种如权利要求1-4中任意一项所述的鸭瘟病毒的亚单位gd蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
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【专利技术属性】
技术研发人员：贾宝琴，张强，徐玉兰，车影，吴素芳，闻雪，钱泓，吴有强，
申请(专利权)人：浙江海隆生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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