【技术实现步骤摘要】
本申请涉及分子检测领域，主要涉及一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器的ota分析方法。
技术介绍
1、赭曲霉毒素a(ota)是赭曲霉毒素家族中的剧毒成员，是由多种曲霉属和青霉属真菌产生的次级代谢产物，可在储存条件不当且暴露于高湿高温的食品中产生，主要污染粮谷类农作物、葡萄酒、咖啡及其制品等食品中。赭曲霉毒素a性质稳定，一般食品加工方式无法破坏其活性，ota具有肾毒性、致癌性、致畸性和免疫毒性，当误食超过限量时会对人体造成巨大伤害。在我国，根据食品安全国家标准gb 2761-2017中，在谷物、豆类及其制品中，ota的允许量不得超过5μg/kg。
2、测定ota的常规分析方法主要有酶联免疫吸附分析(elisa)、高效液相色谱法(hplc)和薄层色谱法(tlc)等方法。然而，这些方法通常需要繁琐的操作、耗时以及昂贵的装置，在ota检测中的应用受到了限制。近些年来，其他方法如表面增强拉曼散射、分光光度法和电化学测定法已被开发用于ota的检测。然而，它们仍然受到繁琐的修饰过程和识别效率低的困扰。由于dna的高特异性、可编程性和稳定性，一些基于dna的扩增方法在食品安全领域中成为了研究热点，例如催化核酸(dnazyme)介导的扩增反应、外切酶介导的扩增反应、催化发夹自组装反应(cda)和杂交链式反应(chr)等。为了提高信号放大能力，通过整合不同的恒温核酸扩增技术，将两种或多种技术进行组合，开发出了各种级联信号放大器，极大的提高了信号的输出强度，但是由于级联的堆叠层数的增加，也限制了其分析效率。中国专利cn11142407
3、综上所述，建立一种高效且高灵敏度的方法来检测食品中的ota在食品安全领域具有重大意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本申请提出了一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器的ota分析方法。此方法巧妙地结合了cda和exo-ⅲ催化水解，显著放大了检测信号。当ota存在时，cda技术能够持续生成稳定的h1/h2双链体结构，导致扩增子s的数量不断累积。这种累积进一步激活了连续循环的exo-iii催化水解反应，从而加速了整个反应过程，极大地增强了ecl的输出信号，直至所有反应物耗尽。该方法不仅具有出色的稳定性，还展现了极高的灵敏度和良好的选择性，使其能够实现对复杂食品样品中ota的高灵敏和精确测定。
2、根据本申请的一方面，提出了一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器，包括：引发链ia和阻断链b、发夹探针h1、发夹探针h2、dna双链l/s*-ru和核酸外切酶exo-iii；所述引发链ia包括i引发序列和ota适配体序列；所述i引发序列包括d、a和b三个部分；所述发夹探针h1包括a、b、c*、b*、a*和d*六个部分，其中a-b与a*-b*互补成双链作为所述h1茎部，c*为发夹结构的环部，d*为在发夹结构茎部延伸出的3’黏性末端，所述h1的3’端接有分裂的扩增子s片段中的d*片段；所述h2包括c*、a、b、c和b*五个部分，其中c与c*互补成双链作为所述h2的茎部，a-b为所述h2的发夹结构的环部，b*为在发夹结构茎部延伸出的3’黏性末端，c*片段是扩增子s的分裂单元；所述扩增子s包括c*和d*两个部分；所述dna双链l/s*-ru包括阻断链l和s*-ru链；所述s*-ru链5’端被ru(bpy)32+修饰。此传感器巧妙地结合了cda和exo-ⅲ催化水解，能够显著放大检测信号。
3、所述引发链ia序列如seq id no.1所示，具体为：5’-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggacagagtgt cggtctctatcattatctttttt-3’。
4、所述阻断链b序列如seq id no.2所示，具体为：5’-ccgacactctgtcctttt-3’。
5、所述发夹探针h1序列如seq id no.3所示，具体为：5’-gtctctatcattatcttgcttcatcttcatcaagataatgata gagaccgacactcttttt-3’。
6、所述发夹探针h2序列如seq id no.4所示，具体为：5’-gcttcatcttcatcttctctatcattatcttgatgaagatgaa gcaagataattttt-3’。
7、所述阻断链l序列如seq id no.5所示，具体为：5’-catcttcatctccgtttt-3’。
8、所述s*-ru链序列如seq id no.6所示，具体为：5’-ru-agtgtcggagatgaagatgaagc-3’。
9、根据本申请的第二方面，提出了一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
10、a1、将s*-ru链与阻断链l放入缓冲溶液中进行均相反应，得到杂交产物l/s*-ru；
11、a2、将引发链ia与阻断链b放入缓冲溶液中进行均相反应，得到杂交产物ia/b；
12、a3、将l/s*-ru、ia/b、发夹探针h1、发夹探针h2和核酸外切酶exo-iii混合，完成适配体传感器的配制。
13、进一步地，所述缓冲溶液含有10mm tris、100mm kcl和2mm mgcl2，所述缓冲溶液ph为7.2。此缓冲溶液能够提供安全、稳定的反应环境。
14、进一步地，所述均相反应条件为35℃，30min。温度对缓冲溶液的ph值影响较大，此温度能够使缓冲溶液的ph值稳定在7.2左右，从而保证反应的稳定进行。
15、根据本申请的第三方面，提出了一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器的ota分析方法，包括以下步骤：
16、s1、配制所述l/s*-ru、ia/b、发夹探针h1、发夹探针h2和核酸外切酶exo-iii的混合液；
17、s2、将ota投入所述混合液中进行反应，得到反应溶液；
18、s3、将所述反应溶液倒入含0.02m tpra的溶液中，得到测试溶液，将电极浸入所述测试溶液中进行ecl检测并读取检测结果。
19、进一步地，所述s2中，ota与混合液的反应温度为35℃，反应时间为1h。
20、进一步地，所述s3中，进行ecl检测时，通过循环伏安法进行扫描，其中，电势范围设置为0.6-1.6v，扫描速率为100mv/s。
21、本方法的工作原理是：
22、当存在目标物ota时，ia中的适配体序列立即与目标物结合并导致引发链i序列的暴露，引发cda反应，i序列的d、a、b可以与发夹探针h1中的d*、a*、b*杂交从而打开h1，生成中间产物ia-h1；h1被打开后释放出c*、b、a序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器，其特征在于，所述适配体传感器包括引发链IA、阻断链B、发夹探针H1、发夹探针H2、DNA双链L/S*-Ru和核酸外切酶Exo-III；所述引发链IA包括I引发序列和OTA适配体序列；所述I引发序列包括d、a和b三个部分；所述发夹探针H1包括a、b、c*、b*、a*和d*六个部分，其中a-b与a*-b*互补成双链作为所述H1茎部，c*为发夹结构的环部，d*为在发夹结构茎部延伸出的3’黏性末端，所述H1的3’端接有分裂的扩增子S片段中的d*片段；所述H2包括c*、a、b、c和b*五个部分，其中c与c*互补成双链作为所述H2的茎部，a-b为所述H2的发夹结构的环部，b*为在发夹结构茎部延伸出的3’黏性末端，c*片段是扩增子S的分裂单元；所述扩增子S包括c*和d*两个部分；所述DNA双链L/S*-Ru包括阻断链L和S*-Ru链；所述S*-Ru链5’端被Ru(bpy)32+修饰；
2.一种如权利要求1所述的基于高效均相电致化学发光适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于高效均相电致化学发光适配
4.根据权利要求2所述的基于高效均相电致化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述均相反应条件为35℃，30min。
5.一种如权利要求1所述的基于高效均相电致化学发光适配体传感器的OTA分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的基于高效均相电致化学发光适配体传感器的OTA分析方法，其特征在于，所述S3中，进行ECL检测时，通过循环伏安法进行扫描，其中，电势范围设置为0.6-1.6V，扫描速率为100mV/s。
7.根据权利要求5-6任一项所述的一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器的OTA分析方法，其特征在于，在食品检测中的应用：将所述L/S*-Ru、IA/B、发夹探针H1、发夹探针H2和核酸外切酶Exo-III混合，得到混合液；将食品样品投入所述混合液中反应1h，得到反应溶液，反应温度为35℃；将所述反应溶液倒入含0.02M TPrA的溶液中，得到测试溶液，将电极浸入所述测试溶液中进行ECL检测并读取检测结果，其中，ECL检测时通过循环伏安法进行扫描，电势范围设置为0.6-1.6V，扫描速率为100mV/s。
8.一种如权利要求1所述的基于高效均相电致化学发光适配体传感器的OTA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引发链IA和阻断链B、发夹探针H1、发夹探针H2、DNA双链L/S*-Ru和核酸外切酶Exo-III。
...【技术特征摘要】
1.一种基于高效均相电致化学发光适配体传感器，其特征在于，所述适配体传感器包括引发链ia、阻断链b、发夹探针h1、发夹探针h2、dna双链l/s*-ru和核酸外切酶exo-iii；所述引发链ia包括i引发序列和ota适配体序列；所述i引发序列包括d、a和b三个部分；所述发夹探针h1包括a、b、c*、b*、a*和d*六个部分，其中a-b与a*-b*互补成双链作为所述h1茎部，c*为发夹结构的环部，d*为在发夹结构茎部延伸出的3’黏性末端，所述h1的3’端接有分裂的扩增子s片段中的d*片段；所述h2包括c*、a、b、c和b*五个部分，其中c与c*互补成双链作为所述h2的茎部，a-b为所述h2的发夹结构的环部，b*为在发夹结构茎部延伸出的3’黏性末端，c*片段是扩增子s的分裂单元；所述扩增子s包括c*和d*两个部分；所述dna双链l/s*-ru包括阻断链l和s*-ru链；所述s*-ru链5’端被ru(bpy)32+修饰；
2.一种如权利要求1所述的基于高效均相电致化学发光适配体传感器的制备方法，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的基于高效均相电致化学发光适配体传感器的制备方法，其特征在于，所述缓冲溶液含有10mm tris、100mm kcl和2mm mgcl2，所述缓冲溶液ph为7.2。
4.根据权利要求2所述的基于高效均相...
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