【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品加工、免疫学及食品安全快速检测领域，具体涉及湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体、免疫层析试纸及应用。
技术介绍
1、食物过敏是免疫系统针对目标蛋白产生的不良反应。根据统计，在世界范围内约有5%的成年人和8%的儿童对食物存在过敏现象。食物过敏的本质是免疫系统对食物的异常反应，即使食用少量的含有过敏原的食物也会导致消化系统紊乱、呼吸道肿胀等问题，甚至在某些特殊情况下，食物过敏还会出现严重的生理症状，威胁生命。
2、花生作为过敏原之一，有时会导致较为严重的，甚至出现生命危险的过敏反应。然而，花生的蛋白质含量丰富，具有极高的营养价值，因此在全球范围内，花生也是蛋白质和食用油的重要来源，这也间接导致花生过敏的发病率持续上升。花生过敏因其具有普遍性、高发性、长期性以及致敏低剂量性，引起世界各国的广泛关注。目前， who-iuis共收录了从ara h l到 ara h 18的17种已知的花生致敏原蛋白(ara h 4被鉴定为ara h 3.02的一种亚基)，其中ara h 1、ara h 2、ara h 3和 ara h 6这四种致敏蛋白由于其含量较高且抗原性较强被认为是主要的花生过敏原，其中ara h 3能被45%-54%的患者血清中的ige识别，是目前研究的热点过敏原蛋白之一。
3、在日常生活中，热处理是常见的食品加工方式，它主要包括煮沸、烹饪、烘烤、油炸、烧烤等，市面上含花生过敏原ara h 3的湿热加工产品种类也较多，例如花生酱、花生牛奶、水煮花生等，这些食物可能会使花生过敏患者产生过敏反应。虽
4、吴枭等人（吴枭，席俊，等. 湿热处理对花生球蛋白ara h 3 抗原性的影响 [ j].河南工业大学学报( 自然科学版)，2023, 44(6) : 44-50.）虽然探究了湿热处理对花生球蛋白ara h 3 抗原性的影响，湿热处理后的ara h 3 荧光强度、表面疏水性增强，三级结构发生变化；游离巯基含量增加、空间结构发生改变，α-螺旋和β-折叠含量降低，无规则卷曲含量增加，二级结构发生变化；湿热处理后ara h 3 空间结构发生改变，部分抗原表位遭到破坏或被包埋，抗原性降低。但是，上述论文中仍没有涉及如何检测湿热处理后的花生过敏原ara h 3的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的主要目的是提供一种湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体、免疫层析试纸及应用，利用该特异性抗体可以用于检测花生过敏原ara h 3是否经过充分的湿热处理，实现了快速检测花生过敏原ara h 3是否经过湿热处理以及湿热处理是否充分，可为花生过敏人群的选择提供参考意见。
2、具体技术方案如下：
3、一种湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，主要由以下方法制得：
4、（1）湿热加工处理花生过敏原ara h 3，得到含湿热加工后ara h 3的上清液；
5、（2）将所述上清液与花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体进行混合孵育；
6、优选地，所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体与湿热加工后的ara h 3的质量比为1: 9.5-10.5。
7、湿热加工抗原表位特异性抗体的制备对于检测ara h 3是否经过湿热处理至关重要，经过湿热加工后，蛋白质的某些抗原表位遭到变性，被加工破坏的表位不在与相应的抗体结合，ara h 3有多个抗原表位，通常情况下多抗能结合多个抗原表位。优选地，在最佳湿热处理条件下加工ara h3，此时加工后的ara h 3的抗原性最低，表明湿热加工后的ara h3有多个抗原表位被破坏。将兔源多克隆抗体与湿热加工后ara h 3充分反应，因抗原表位被破坏，部分抗体无法与抗原结合，此部分抗体为湿热加工破坏抗原表位特异性抗体。
8、制备所述湿热加工破坏抗原表位特异性抗体时，确定抗原与抗体的质量比至关重要。若湿热加工后ara h 3抗原量过高，则制备的湿热加工破坏抗原表位特异性抗体纯度将会太差，不能很好拦截未加工的抗原，从而使得后续制备的免疫层析试纸t线不显色；若兔源多克隆抗体量过高，则不能很好的制备出湿热加工破坏抗原表位特异性抗体，从而使得后续制备免疫层析试纸不能判定ara h3是否经过充分的湿热加工。所以，本专利技术限定所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体与湿热加工后ara h 3的质量比为1: 9.5-10.5。
9、所述步骤（1）包括：先将所述花生过敏原ara h 3溶液置于80℃-100℃湿热处理25- 40 min，得到混合液；对所述混合液进行离心处理，获得含所述湿热加工后ara h3的上清液。优选地，所述花生过敏原ara h 3的浓度为9 - 12 mg/ml。
10、所述步骤（2）包括：将所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体与湿热加工后arah 3的上清液充分混合，并于4℃反应11-13 h，即可得到湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体；
11、优选地，所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体的浓度为2.1-4.2 mg/ml；
12、优选地，所述湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体的浓度为0.6-1 mg/ml。
13、所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体主要由以下方法制得：先以花生过敏原ara h 3为抗原对健康兔子采用颈部皮下注射的方式进行多次免疫处理，直至达到能作为抗体的要求；再收集血清，即可得到兔源多克隆抗体原始血清；然后对所述兔源多克隆抗体原始血清进行纯化处理，得到花生过敏原ara h3兔源多克隆抗体。优选地，所述兔源多克隆抗体原始血清的效价为1:1.6384×106，所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体的效价为1: 3.2768×106。
14、现有市面上兔源多克隆抗体制备大多在免疫四次后测效价，若效价达到50万以上，可进行第五次加强免疫，若免疫次数太多，可能会导致兔子出现免疫耐受现象，即兔子不能在抗原刺激下，不能被激活，不能产生特异性免疫效应细胞及特异性抗体，从而不能执行正常免疫应答的现象，因此经验证，上述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体经过免疫5次即可。
15、所述纯化处理的步骤包括：采用饱和硫酸铵分级沉淀法对所述兔源多克隆抗体原始血清进行纯化处理。具体地，先将所述原始兔源多克隆抗体、pbs缓冲液和饱和硫酸铵溶液混合过夜，再经过两次离心及pbs缓冲液（磷酸盐电解缓冲溶液）复溶处理，得到兔源多克隆抗体溶液；对所述兔源多克隆抗体溶液进行透析处理，即可得到纯化的兔源多克隆抗体。
16、一种湿热处理的花生过敏原ara h 3检测体系，包括胶体金标记兔源多克隆抗体和上述湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其中，所述湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体为未经湿热加工的花生过敏原ara h 3的特异性抗体，所述胶体金标记兔源多克隆抗体主要由胶体金、牛血清蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，主要由以下方法制得：
2.根据权利要求1所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其特征在于，所述步骤（1）包括：先将所述花生过敏原Ara h 3溶液置于80℃-100℃湿热处理25 - 40 min，得到混合液；对所述混合液进行离心处理，获得含所述湿热加工后Ara h 3的上清液；
3.根据权利要求2所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其特征在于，所述步骤（2）包括：将所述花生过敏原Ara h 3兔源多克隆抗体与湿热加工后Ara h 3的上清液充分混合，并于4℃反应11-13 h，即可得到湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体；
4.根据权利要求1-3任一项所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其特征在于，所述花生过敏原Ara h 3兔源多克隆抗体主要由以下方法制得：先以花生过敏原Ara h 3为抗原对健康兔子采用颈部皮下注射的方式进行多次免疫处理，直至达到能作为抗体的要求；再收集血清，即可得到兔源多克隆抗体原始血清；然后对所述兔源多克隆抗体原始血清进行纯化处理，得到花生过敏原Ara h 3兔源多克隆抗
5.根据权利要求4所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其特征在于，所述纯化处理的步骤包括：采用饱和硫酸铵分级沉淀法对所述兔源多克隆抗体原始血清进行纯化处理。
6.一种湿热处理的花生过敏原Ara h 3检测体系，其特征在于，包括胶体金标记兔源多克隆抗体和权利要求1-5任一项所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其中，所述胶体金标记兔源多克隆抗体主要由胶体金、牛血清蛋白和所述花生过敏原Ara h 3兔源多克隆抗体进行混合孵育制得。
7.一种免疫层析试纸，包括样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫，其中，所述层析膜上设置有检测线和质控线，其特征在于，权利要求1-5任一项所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体滴加于所述层析膜的检测线上，所述结合垫上滴加有免疫探针溶液，其中，所述免疫探针溶液主要由胶体金、牛血清蛋白和所述花生过敏原Ara h 3兔源多克隆抗体进行混合孵育制得胶体金标记兔源多克隆抗体；所述质控线上滴加有葡萄球菌A蛋白。
8.一种权利要求7所述的免疫试纸的制备方法，包括步骤：
9.一种权利要求6所述的湿热处理的花生过敏原Ara h 3检测体系或权利要求7所述的免疫试纸在检测花生产品中的花生过敏原Ara h 3中的应用；
...【技术特征摘要】
1.一种湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，主要由以下方法制得：
2.根据权利要求1所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其特征在于，所述步骤（1）包括：先将所述花生过敏原ara h 3溶液置于80℃-100℃湿热处理25 - 40 min，得到混合液；对所述混合液进行离心处理，获得含所述湿热加工后ara h 3的上清液；
3.根据权利要求2所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其特征在于，所述步骤（2）包括：将所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体与湿热加工后ara h 3的上清液充分混合，并于4℃反应11-13 h，即可得到湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体；
4.根据权利要求1-3任一项所述的湿热加工破坏抗原表位的特异性抗体，其特征在于，所述花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体主要由以下方法制得：先以花生过敏原ara h 3为抗原对健康兔子采用颈部皮下注射的方式进行多次免疫处理，直至达到能作为抗体的要求；再收集血清，即可得到兔源多克隆抗体原始血清；然后对所述兔源多克隆抗体原始血清进行纯化处理，得到花生过敏原ara h 3兔源多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的湿热加工破坏...
【专利技术属性】
技术研发人员：席俊，杨硕，孙富宇，吴枭，黄芃博，范雨函，孟珺，崔媛媛，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：
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