【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于临床生物传感诊断，涉及一种唾液il-6生物传感微芯片的制备方法。
技术介绍
1、口腔癌是世界第六大癌症，且近些年口腔癌发病率有增加趋势。2018年全球约有354000例口腔癌，死亡案例达到了177000例。口腔癌患者的5年生存率约为50%，随着发展阶段的延伸，5年生存率进一步低至15%。口腔癌的高死亡率主要归因于发病早期无明显症状导致患者忽视，进而延误病情诊断和治疗。因而口腔癌的早期诊断对阻止病情恶化，降低死亡率至关重要。目前，组织病理活检是临床中口腔癌诊断的金标准，但这并不是一种早期诊断方法，而且侵入的检测方式会给病人造成身体和心理上的负担。
2、近年来，基于唾液的无创检测受到了越来越多的关注。唾液含有多种可以分析的物质，包括水、电解质、核酸、蛋白质、激素、酶等，它们通过跨细胞或旁细胞的途径直接来自血液，与血液成分高度相关，被誉为“人体的镜子”。此外，由于唾液可以与口腔癌病变部位密切接触，且采样简单、无创，使其成为检测口腔癌的理想生物流体。il-6是口腔癌的早期标记物，可以在分泌在唾液中反映口腔癌的发生，但由于其较低的含量，目前还没有理想的检测il-6的生物传感器被报道。
技术实现思路
1、本专利技术针对传统口腔癌早期标志物il-6检测中存在的问题提出一种新型的生物传感微芯片的制备方法。
2、为了达到上述目的，本专利技术是采用下述的技术方案实现的：
3、一种唾液il-6生物传感微芯片的制备方法，步骤如下:
4、（1）取
5、（2）将聚苯乙烯微球（ps）原液加入去离子水中，混合均匀得到前驱体分散液，将前驱体分散液滴涂在微芯片基底正面，静置干燥后置于去离子水中，并往去离子水中滴加表面活性剂，然后快速取出微芯片基底，烘干，得到单层ps阵列模板电极。
6、（3）将单层ps阵列模板电极置于氯金酸溶液中进行电沉积，得到ps/au电极；将ps/au电极置于脱模板溶剂中，浸没后冲洗、干燥，得到aung电极；将aung电极依次浸入k4[fe(cn)6]溶液及fecl3溶液中，重复交替若干次，烘干，得到pb/aung微芯片。
7、（4）将壳聚糖溶液滴涂在pb/aung微芯片表面，干燥后滴加il-6抗体溶液，低温干燥后，滴涂牛血清蛋白溶液并干燥，获得il-6传感微芯片。
8、作为优选，步骤（1）中参比电极为ag/agcl，对电极为碳电极，超声清洗过程为将印刷参比电极和对电极的基底依次浸入丙酮、乙醇、去离子水中各超声至少5 min。
9、作为优选，步骤（2）中前驱体分散液质量浓度为1-1.5wt%，滴涂量为20-50 μl，表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇醚硫酸钠中的任意一种，烘干温度为75-85℃，烘干时间为3-5 min。
10、作为优选，步骤（3）中氯金酸溶液浓度为5-10 mm，电沉积电压为-0.3v，电沉积时间为4-5 min，脱模板溶剂为二氯甲烷、丙酮、甲苯中的任意一种，脱模板的时间为1-2 h，冲洗采用乙醇和去离子水交替进行若干次。
11、作为优选，步骤（3）中k4[fe(cn)6]溶液和fecl3溶液的浓度均为5-15 mm，aung电极依次浸入k4[fe(cn)6]溶液及fecl3溶液中的时间均为60-90 s，并重复交替40-50次；烘干温度为60-80℃，烘干时间为1-2 h。
12、作为优选，步骤（4）中壳聚糖溶液的浓度为3-5 mg/ml，滴涂体积为4-5 μl；il-6抗体溶液的浓度为1-3 μg/ml，滴涂体积为8-10 μl，牛血清蛋白溶液的浓度为3-5 mg/ml，滴涂体积为1-3 μl；滴加抗体溶液后低温干燥温度为4℃，干燥时间为12 h以上。
13、本专利技术提出上述方法制备得到的生物传感微芯片在早期无创口腔癌唾液诊断产品中的应用，所述产品包括但不限于诊断传感器、诊断装置、诊断试剂盒等。
14、本专利技术方案得到国家重点研发计划项目资助，项目名称为：生物反应器与智能生物制造，项目编号：2021yfc2101100。
15、本专利技术为实现il-6的快速特异性检测，设计了一种具有纳米网络结构的pb/au复合物，该复合物具有较大的比表面积，能固定更多的特异性抗体，且具有更强的催化能力，从而放大检测信号。制备过程中，pb作为氧化还原介质，结合au优异的导电能力，使得制备得到的材料电子传输能力显著增强。本专利技术采用壳聚糖作为连结剂，固定il-6特异性抗体，通过电流减弱型的位阻策略实现il-6的灵敏检测。壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有独特的物理化学特性和生理功能，如：优良的增稠剂，分散性，保湿性，成膜性和凝胶性等。此外，壳聚糖分子链上存在大量的氨基与羟基，可利用共价交联法与生物活性材料相结合。本专利技术通过将壳聚糖涂覆在pb/aung表面，再固定抗体分子，制备免疫传感电极。壳聚糖自身的黏性使其可稳固粘附在pb/aung表面，壳聚糖中的氨基可共价结合抗体中的羧基，从而达到固定抗体的作用。当唾液中的il-6抗原与电极表面的抗体由于结构互补性与亲和性发生特异性结合后，导电性差的il-6抗原会引起电极表面的电流减弱。通过分析该电流的变化与il-6抗原的浓度的关系，可得到线性回归曲线或方程，从而实现il-6的准确检测。
16、与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果在于：
17、1.本专利技术所提出的三电极微芯片，实现了纳米材料原位修饰，具有微型化和便携性等优点。
18、2.本专利技术pb/aung纳米结构具有高比表面积和电催化活性，使得传感器具有极低检测下限与高灵敏度。且该材料高比表面积的特点，使其能够负载更多的抗体，从而灵敏识别低浓度的目标物。
19、3.本专利技术设计的传感器具有优异的选择性，在20 min内能准备识别唾液中存在的il-6，为早期无创诊断口腔癌提供可能。
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1.一种唾液IL-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤如下:
2.根据权利要求1所述唾液IL-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（1）中参比电极为Ag/AgCl，对电极为碳电极，超声清洗过程为将印刷参比电极和对电极的基底依次浸入丙酮、乙醇、去离子水中各超声至少5 min。
3.根据权利要求1所述唾液IL-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（2）中前驱体分散液质量浓度为1-1.5wt%，滴涂量为20-50 μL，表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇醚硫酸钠中的任意一种，烘干温度为75-85℃，烘干时间为3-5 min。
4.根据权利要求1所述唾液IL-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（3）中氯金酸溶液浓度为5-10 mM，电沉积电压为-0.3V，电沉积时间为4-5 min，脱模板溶剂为二氯甲烷、丙酮、甲苯中的任意一种，脱模板的时间为1-2 h，冲洗采用乙醇和去离子水交替进行若干次。
5.根据权利要求1所述唾液IL-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（3）
6.根据权利要求1所述唾液IL-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（4）中壳聚糖溶液的浓度为3-5 mg/mL，滴涂体积为4-5 μL；IL-6抗体溶液的浓度为1-3 μg/mL，滴涂体积为8-10 μL，牛血清蛋白溶液的浓度为3-5 mg/mL，滴涂体积为1-3 μL；滴加抗体溶液后低温干燥温度为4℃，干燥时间为12 h以上。
7.权利要求1-6任意一项方法制备得到的生物传感微芯片在早期无创口腔癌患者唾液诊断产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种唾液il-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤如下:
2.根据权利要求1所述唾液il-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（1）中参比电极为ag/agcl，对电极为碳电极，超声清洗过程为将印刷参比电极和对电极的基底依次浸入丙酮、乙醇、去离子水中各超声至少5 min。
3.根据权利要求1所述唾液il-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（2）中前驱体分散液质量浓度为1-1.5wt%，滴涂量为20-50 μl，表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇醚硫酸钠中的任意一种，烘干温度为75-85℃，烘干时间为3-5 min。
4.根据权利要求1所述唾液il-6生物传感微芯片的制备方法，其特征在于，步骤（3）中氯金酸溶液浓度为5-10 mm，电沉积电压为-0.3v，电沉积时间为4-5 min，脱模板溶剂为二氯甲烷、丙酮、甲苯中的任意一种，脱模板的时...
【专利技术属性】
技术研发人员：金万勤，牟永斌，储震宇，董衡，张静，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：
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