【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药领域，尤其是纳米生物偶联体递药系统的制备方法及其应用。该类递药系统可在肝纤维化的高活性氧微环境下，消耗ros改善肝纤维化病理微环境，并使连接臂硼酸酯键响应性断裂，释放出负载自噬抑制剂的纳米粒hnp和具有免疫调节作用的工程化细胞外囊泡aev，通过多管齐下治疗策略发挥高效协同抗纤维化治疗作用。
技术介绍
1、肝纤维化是各种慢性肝病进程中的一个重要发展阶段，病毒感染、胆汁淤积、药物毒副作用等多种因素都会诱发肝纤维化[journal of hepatology,2019,70,151-171]。肝纤维化是伴随各种慢性肝病的一种以细胞外基质和胶原过度沉积为特征的慢性肝损伤，其发生发展是多因素、多基因、多阶段结合的复杂过程。截至目前，临床上仍没有有效药物被批准用于肝纤维化的治疗[acs nano,2021,15,7547-7562]。
2、在早期阶段，肝细胞的持续损伤会引发活性氧的过量产生，从而破坏肝脏微环境的稳态。在活性氧反复刺激下，静止状态的肝星状细胞被激活，破坏细胞外基质合成与降解的平衡，导致纤维结缔组织过度沉积，最终促使肝纤维化的发生。所以肝星状细胞的激活被认为是肝纤维化发病的主要驱动力。与此同时，炎症微环境在肝纤维化中的作用不容忽视，巨噬细胞是受损肝脏中主要的炎症细胞，通过产生细胞因子和趋化因子，与多种类型细胞在纤维化发生过程中存在复杂的相互作用。文献表明，在肝纤维化的发病过程中，巨噬细胞分泌的炎性因子会导致肝星状细胞的持续活化，进而促进肝纤维化进程。巨噬细胞和活化的肝星状细胞构成了一个由活性氧驱动的
3、近年来的研究表明，自噬可以促进肝星状细胞的活化，而抑制自噬可以降低其活化，从而阻止肝纤维化的进展[journal of hepatology,2011,55,1176-1177]。羟基氯喹是一种常见的自噬抑制剂，可抑制肝星状细胞的活化而阻止纤维化的发展。研究发现，在肝纤维化的发展过程中，自噬对不同类型肝脏细胞的作用截然相反。因此，特异性靶向递送羟基氯喹到活化的肝星状细胞可能是一种治疗肝纤维化的重要治疗方法。活化的肝星状细胞表面高表达视黄醇结合蛋白受体，通过视黄醇可精准靶向到肝星状细胞，进而通过特异性抑制自噬达到缓解肝纤维化的效果。
4、间充质干细胞的免疫调节和抗炎症能力在包括肝纤维化在内的疾病中表现出治疗潜力。越来越多的证据表明，间充质干细胞的免疫调节功能主要是由于其旁分泌途径，其中细胞外囊泡是最主要的成份。项目组脐带间充质干细胞来源的组织工程化细胞外囊泡aev[biomaterials,2021,279,121223]可通过表面的磷脂酰丝氨酸蛋白被巨噬细胞摄取，减少m1型巨噬细胞促炎因子的分泌，进而减缓肝星状细胞的活化并改善肝纤维化的炎症微环境。因此，负载羟基氯喹的纳米粒和工程化细胞外囊泡的结合可以有效地克服单一疗法的局限性，达到协同治疗肝纤维化的疗效。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法及其应用。
2、本专利技术的目的是提供一种微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，该设计利用纳米粒表面易修饰特点，制备得到负载羟基氯喹的视黄醇和马来酰亚胺基团硼酸酯修饰的纳米粒hnp-b，然后利用hnp-b表面的马来酰亚胺基团与工程化细胞外囊泡aev表面的巯基通过共价结合得到纳米生物偶联体递药系统hnp-b-aev。hnp-b-aev在肝纤维化高ros的情况下，可响应性地释放出视黄醇修饰的靶向纳米粒hnp和工程化细胞外囊泡aev，同时消耗ros改善肝纤维化病理微环境。hnp可特异性精准靶向到活化的肝星状细胞，实现羟基氯喹对肝星状细胞的特异性活化抑制；工程化细胞外囊泡aev通过磷脂酰丝氨酸蛋白介导被巨噬细胞吞噬，抑制m1型巨噬细胞促炎因子的分泌，进而抑制肝星状细胞的活化，通过多管齐下治疗策略发挥高效协同抗纤维化治疗作用，从源头上消除肝纤维化的进展，为肝纤维化的临床治疗提供新的策略。
3、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案包括如下步骤：
4、一种微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，以3-氨基苯基硼酸和顺丁烯二酸酐为原材料，二者通过酰化反应得到中间产物3-(马来酰亚胺)苯硼酸，进一步与单硬脂酸甘油酯反应生成gms-pba-mal。所得gms-pba-mal与cls-peg2000-va、氢化卵磷脂、plga和羟基氯喹形成纳米粒hnp-b。纳米粒hnp-b表面的马来酰亚胺基团与工程化细胞外囊泡aev表面的巯基通过共价结合得到纳米生物偶联体递药系统hnp-b-aev。
5、一种微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法的具体步骤如下：
6、步骤(1)：将顺丁烯二酸酐在室温条件下搅拌溶解于无水四氢呋喃，随后加入3-氨基苯基硼酸，室温搅拌1h，真空旋蒸得到反应物a备用；向反应物a中加入乙酸酐和醋酸钠，在-20℃～120℃下搅拌反应0.5～5h，得到反应液b，然后向反应液b加入冷水，收集沉淀，减压干燥得到中间产物3-(马来酰亚胺)苯硼酸(pba-mal)；将单硬脂酸甘油酯加入到溶解pba-mal的甲苯溶液中，在0℃～150℃下搅拌反应1～10h，在氮气保护下进行回流反应。最后经三乙胺碱化后，柱层析并真空干燥得到单硬脂酸甘油苯硼酸酯(gms-pba-mal)；
7、步骤(2)：将氢化卵磷脂，cls-peg2000-va，gms-pba-mal和羟基氯喹溶于乙醇溶液中。采用vcx130超声破碎仪以20khz的频率和130w的功率超声分散上述混合液，时间1～60min，并在超声下将聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)的丙酮溶逐滴滴入上述混合溶液中。离心，纯水清洗两次得到纳米粒hnp-b；
8、步骤(3)：将纳米粒hnp-b与提取的工程化细胞外囊泡aev混匀收集在离心管中，在37℃摇床上恒温振荡孵育0.5～24h，离心洗涤得到纳米生物偶联体递药系统hnp-b-aev。
9、在具体制备过程中，所述步骤(1)中，3-氨基苯基硼酸与顺丁烯二酸酐的摩尔比为3:1～3:1；乙酸酐与醋酸钠的摩尔比为3:1～1:3；单硬脂酸甘油酯与3-(马来酰亚胺)苯硼酸的摩尔比为3:1～1:3。
10、所述步骤(2)中，三种材料氢化卵磷脂，cls-peg2000-va和gms-pba-mal的质量比为3:2:1～1:2:3；羟基氯喹与上述三种材料总量的投料质量比为1:1～1:50。
11、所述步骤(3)中，hnp-b(以其总质量计)与aev(以其包含总蛋白量计)的投料质量比为1:50～50:1。
12、本专利技术的有益效果是：
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【技术保护点】
1.一种微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
2.根据权利要求1所述的微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于其制备方法的具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于：
4.根据权利要求2所述的微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于：
5.根据权利要求2所述的微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于：
6.按照权利要求1-5制备方法得到的微环境响应性纳米生物偶联体递药系统在制备治疗肝纤维化疾病药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
2.根据权利要求1所述的微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于其制备方法的具体步骤如下：
3.根据权利要求2所述的微环境响应性纳米生物偶联体递药系统的制备方法，其特征在于：
<...【专利技术属性】
技术研发人员：张邦乐，邢婕华，隋秉东，侯丽爽，何炜，周四元，张耀文，翟晓沛，张堂睿，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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