【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，特别涉及一种犬常见遗传病的复合扩增引物组合、检测试剂盒及应用。
技术介绍
1、自从犬被人类驯养起来，许多品种的犬在漫长的选择育种过程中患上很多疾病，63％的犬死于这些“家族遗传病”。遗传病是由于先天基因缺陷导致的疾病，也就是从受精卵那一刻起就存在这种基因缺陷，这种基因缺陷是从父母那遗传来的，并且这种基因缺陷会遗传给下一代。
2、由于缺少科学指引，犬的无序繁殖导致了犬基因突变、缺陷基因累积、犬遗传病传播等不良情况。其中，遗传病的遗传模式主要有两种：隐性遗传和显性遗传。所谓隐性遗传，只有携带两个拷贝基因突变时才会发生疾病。而显性遗传，只要携带一个拷贝的基因突变就会发病。显性遗传由于当代即表现出疾病症状，很容易被发现，一般不建议繁育，从而减少了致病基因在种群内的遗传。而具有隐性遗传病的犬，表面上看似健康，却有可能携带致病基因，并会将带病的基因遗传给后代，这就大大增加了后代犬中患病的几率。因此，为了减少了犬遗传疾病的发生，基因检测成为有力工具。基因检测不仅可以在一定程度上预知疾病风险，通过有针对性的回避危险因素，达到控制或延缓疾病发生及延长寿命的目的，并且能够准确检测出狗狗是否患遗传疾病或者携带突变致病基因，为犬的健康养育和繁育提供科学指导。
3、相关研究表明，基因突变(包括snp或indel)会导致犬出现遗传性疾病。其中，snp全称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms)，是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。用于检测snp
技术实现思路
1、本专利技术目的在于公开了一种犬常见遗传病的复合扩增引物组合、检测试剂盒及应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
2、本专利技术第一方面在于提供一种引物组合。
3、本专利技术第二方面在于提供一种含有本专利技术第一方面所述引物组合的检测试剂盒。
4、本专利技术第三方面在于提供本专利技术第一方面所述引物组合或本专利技术第二方面所述检测试剂盒在犬只遗传育种中的应用。
5、本专利技术第一方面所述引物组合用于复合扩增犬的五种常见遗传病的十个关键突变位点，分别是ryr1基因的c.1640t>c突变，vwf基因的c.7437g>a突变，sod1基因的c.118g>a突变，mdr1基因的c.227_230缺失，pde6b基因的c.2404_2406缺失和c.2448_2449插入(tgaagtcc)，pde6a基因的c.1940缺失，cnga1基因的c.1752_1755缺失，cngb1基因的c.2387缺失&2389_2390插入(agctac)，以及nphp4基因的g.62913591_62913770缺失。所述引物组合能够在复合扩增体系中同时扩增出上述十个犬突变位点的核苷酸片段，令用户通过扩增产物的长度即可获知所述突变位点的分型状况，无需进行高成本的基因测序也能够获知犬只是否具有遗传病基因。
6、在本专利技术第一方面的一些应用实施方式中，所述引物组合包含23条引物片段，如seq id no:1至seq id no:3所示的引物片段用于扩增ryr1基因，如seq id no:4至seq idno:6所示的引物片段用于扩增vwf基因，如seq id no:7至seq id no:9所示的引物片段用于扩增sod1基因，如seq id no:10至seq id no:11所示的引物片段用于扩增mdr1基因，如seq id no:12至seq id no:13所示的引物片段用于扩增pde6b基因的c.2404_2406缺失，如seq id no:14至seq id no:15所示的引物片段用于扩增pde6b基因的c.2448_2449插入，如seq id no:16至seq id no:17所示的引物片段用于扩增pde6a基因，如seq id no:18至seqid no:19所示的引物片段用于扩增cnga1基因，如seq id no:20至seq id no:21所示的引物片段用于扩增cngb1基因的c.2387缺失&2389_2390插入，如seq id no:22至seq id no:23所示的引物片段用于扩增nphp4基因。
7、恶性高热：一种遗传性骨骼肌疾病，其特征是高碳酸、横纹肌溶解、全身性骨骼肌挛缩、心律失常和肾功能衰竭，在暴露于琥珀胆碱或挥发性麻醉剂后发生。该遗传病与ryr1基因的c.1640t>c突变有关，对于正常犬来说，该基因位点的分型应为t型纯合子，当某犬个体在该位点的t碱基发生突变至c碱基时，会导致ryr1蛋白中547号氨基酸由缬氨酸转变为丙氨酸，表现出恶性高热的异常表型。
8、i型血管性血友病：是犬类中由于体内凝血因子分泌水平过低导致的一种遗传性出血性疾病，是由血管性血友病因子(vwf)第43外显子最后一个核苷酸的g突变为a所致(c.7437g>a)。该突变激活了正常剪接位点上游几个核苷酸处的一个隐蔽剪接位点，导致蛋白质缩短。大多数发生基因突变的犬会表现出轻微出血症状，包括鼻子和牙龈出血及创伤或术后的出血过多。有时也会存在危及生命的大出血。
9、退行性脊髓病：是一种存在于德国牧羊犬、拳击犬等多个犬种中的渐进性神经性遗传病，与sod1基因的c.118g>a突变有关。高风险犬症状主要表现为渐进性肌肉萎缩及由神经病变导致的后肢运动不协调，该疾病通常不会使患病犬感到疼痛，但是病情会不断发展，直到患病犬完全瘫痪。由于退化性脊髓病的初期发病症状与髋关节发育不良、关节炎和腰椎间盘突出等疾病很相似，因此仅通过临床症状判断十分容易造成误诊。
10、多重药物敏感：多重药物敏感是由mdr1基因缺陷引起，突变位点为c.227_230del，是存在于牧羊犬等很多犬种中的一种遗传病。正常犬在该基因位点的分型是完整纯合子，不会表现出异常药物敏感性的；而检测到两个突变的mdr1等位基因的高风险犬，在服用莫西菌素、伊维菌素或多拉菌素等药物后，会出现明显的神经毒性迹象，包括共济失调、爬行、听觉和触觉过度兴奋和线粒细胞缩本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.引物组合，其特征在于，包括用于复合扩增RYR1基因、vWF基因、SOD1基因、MDR1基因、PDE6B基因、PDE6A基因、CNGA1基因、CNGB1基因和NPHP4基因的引物片段。
2.根据权利要求1所述引物组合，其特征在于，所述引物片段的核苷酸序列分别如SEQID No:1至SEQ ID No:23所示。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，包括PCR Master Mix、sdH2O和权利要求1或2所述引物组合。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No:3、SEQ IDNo:6、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ ID No:12、SEQ ID No:14、SEQ ID No:16、SEQ IDNo:18、SEQ ID No:20和SEQ ID No:22所示的引物片段的5’端标记有荧光染料。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No:3、SEQID No:6、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10、SEQ ID No
6.根据权利要求4或5所述检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料选自FAM、HEX、SUM、LYN、PUR、A514、TAMRA、ROX、VIC、A555、PET、NED、TAZ、A488、SF488或A568。
7.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No:1至SEQ IDNo:23所示的引物片段的反应浓度依次为：0.05μM、0.05μM、0.10μM、0.07μM、0.07μM、0.14μM、0.05μM、0.05μM、0.10μM、0.10μM、0.10μM、0.12μM、0.12μM、0.07μM、0.07μM、0.10μM、0.10μM、0.06μM、0.06μM、0.10μM、0.10μM、0.06μM、0.06μM。
8.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，还包括1个野生型质控品和/或1个突变型质控品。
9.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒的扩增程序包括：95℃持续5分钟；94℃持续30秒，59℃持续1分钟，72℃持续50秒，重复30个循环；72℃持续20分钟；16℃维持。
10.权利要求1至2任一项所述引物组合或权利要求3至9任一项所述检测试剂盒在犬只遗传育种中的应用。
...【技术特征摘要】
1.引物组合，其特征在于，包括用于复合扩增ryr1基因、vwf基因、sod1基因、mdr1基因、pde6b基因、pde6a基因、cnga1基因、cngb1基因和nphp4基因的引物片段。
2.根据权利要求1所述引物组合，其特征在于，所述引物片段的核苷酸序列分别如seqid no:1至seq id no:23所示。
3.一种检测试剂盒，其特征在于，包括pcr master mix、sdh2o和权利要求1或2所述引物组合。
4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，核苷酸序列如seq id no:3、seq idno:6、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq idno:18、seq id no:20和seq id no:22所示的引物片段的5’端标记有荧光染料。
5.根据权利要求4所述检测试剂盒，其特征在于，所述核苷酸序列如seq id no:3、seqid no:6、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:12所示的引物片段的5’端标记同一种荧光染料，所述核苷酸序列如seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20和seq id ...
【专利技术属性】
技术研发人员：李涛，魏荣兴，请求不公布姓名，廖金，请求不公布姓名，
申请(专利权)人：公安部南昌警犬基地，
类型：发明
国别省市：
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