【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及发酵工程，特别涉及外源蛋白收获以及色素去除的方法。
技术介绍
1、发酵工程，是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，巴斯德毕赤酵母是一种优秀的外源蛋白表达系统，具有操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，其菌体密度可达250 g/l~400 g/l的湿重甚至更高，外源蛋白表达量可以达到10 g/l~20 g/l甚至更高，被广泛应用于重组蛋白的生产，如胰岛素类似物、人血白蛋白、蛋白酶等等。
2、目前，由于毕赤酵母发酵液的高密度，料液固含量高、粘度大，其固液分离、外源蛋白收获面临着巨大的挑战，目前以絮凝、死端过滤、管式流离心机和碟片式离心机为主，传统的絮凝和过滤都涉及外源物料的引入、如絮凝剂和助滤剂，存在工艺风险，无法实现在位清洗。管式流离心机可以达到高的澄清度与回收率，但需要定量进行固体卸料和腔体清洗，不适用于大量的发酵液的处理，也无法实现自动化生产和在位清洗。碟片式离心机可以做到持续作业，但收率低，能耗高，噪音大，部分上清液会跟随固体排料而损失掉。
3、关于毕赤酵母发酵液色素去除方法，主要有活性炭为主的吸附法、以硫酸铵为主的沉淀法及以离子交换层析为主的层析法3种方法。3种方法均可实现色素的去除，但工艺在成本控制、操作复杂性以及去除效率等方面均有一定缺陷。
4、活性炭方法中，活性炭的引入给后续该物质的去除工艺带来的负担，同时，活性炭的非特异性吸附会造成目标成分的损失。硫酸铵沉淀方法中，色素去除能力较差，且高浓度硫酸铵可能对蛋白结构有
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了外源蛋白收获以及色素去除的方法，有效解决高密度发酵液中外源蛋白的收获，以及色素的去处两大难题。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了从发酵液中收获外源蛋白的同时去除色素的方法，包括：取两种不同孔径的中空纤维对所述发酵液进行切向流过滤；
4、所述中空纤维包括中空纤维a和中空纤维b；
5、所述中空纤维a的孔径为x，所述中空纤维b的孔径为y，x>y；
6、所述外源蛋白的粒径为p，x>p>y。
7、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法包括如下步骤：
8、步骤（1）：使所述发酵液以0.05~0.1 mpa跨模压经过所述中空纤维a，收集滤出液；
9、步骤（2）：使所述滤出液以0.05~0.1 mpa跨模压经过所述中空纤维b，收集截留液，获得所述外源蛋白。
10、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法中，在使所述发酵液以0.05~0.1 mpa跨模压经过所述中空纤维a之后、收集滤出液之前，还包括补充收获缓冲液使所述外源蛋白充分滤过的步骤。
11、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法中，在使所述滤出液以0.05~0.1 mpa跨模压经过所述中空纤维b、收集截留液之前，还包括补充收获缓冲液使所述色素充分滤过的步骤。
12、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法：
13、所述收获缓冲液包括磷酸盐缓冲液和/或tris-hcl缓冲液；和/或
14、所述收获缓冲液的ph为3.0~7.0；和/或
15、所述收获缓冲液的浓度为0.01~0.1 mol/l。
16、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法：
17、所述中空纤维a的材质为聚偏氟乙烯，膜面积为7 m2~35 m2；和/或
18、所述中空纤维b的材质为聚醚砜，膜面积为7 m2~35 m2。
19、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法：
20、所述中空纤维a的孔径为700~800 kd；和/或
21、所述中空纤维b的孔径为3~10 kd。
22、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法的所述收获缓冲液为0.01 mol/ltris-hcl缓冲液，ph为5.0。
23、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法的所述中空纤维a的材质为聚偏氟乙烯，膜面积为7 m2；
24、所述中空纤维b的材质为聚醚砜，膜面积为7 m2。
25、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法的所述中空纤维a的孔径为750 kd；
26、所述中空纤维b的孔径为3 kd。
27、本专利技术还提供了利用中空纤维进行毕赤酵母工程菌高密度发酵液的收获的方法，是用中空纤维切向流分离细胞与上清液、去除色素，收获外源蛋白的方法。
28、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法分离的是毕赤酵母高密度发酵液，最高允许湿重250 g/l~300 g/l，不需要进行离心处理。
29、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法的上清中外源蛋白的高收率，收率≥90%。
30、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法能够完全去除发酵液中黄、绿色素。
31、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法收获使用的中空纤维包括两个部分，用于固液分离的中空纤维a，用于超滤浓缩的中空纤维b。
32、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法用于固液分离的中空纤维a是聚偏氟乙烯（pvdf）等高强度、耐腐蚀材质、750 kd孔径、7 m2~35 m2膜面积。
33、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法用于外源蛋白超滤浓缩的中空纤维b是聚醚砜（pes）等材质、3 kd~10 kd孔径、7 m2~35 m2膜面积。
34、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法具体步骤为：
35、（a）毕赤酵母的发酵液利用中空纤维a，以0.05~0.1 mpa跨模压，持续进样，收集滤出液；
36、（b）参照滤出液滤出速度，向毕赤酵母的发酵液中补充收获缓冲液，使发酵液体积保持不变，收获缓冲液为发酵上清液的3倍体积，至收获缓冲液补充完，发酵液为原始体积停止。
37、（c）透过液利用中空纤维b，以0.05~0.1 mpa跨模压，持续进样，收集截留液，使用3倍体积的收获缓冲液进行连续洗滤，至截留液体积等于发酵液上清体积为止。
38、（d）收集截留液，即为终品外源蛋白液，其体积等同于发酵液上清体积，色素完全去除，收率经考马斯亮蓝测定可达90%以上。
39、在本专利技术的一些具体实施方案中，上述方法的收获缓冲液为磷酸盐/tris-hcl缓冲液，ph范围在3.0~7.0，摩尔浓度0.01~0.1 mol/l。
40、本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.从发酵液中收获外源蛋白的同时去除色素的方法，其特征在于，包括：取两种不同孔径的中空纤维对所述发酵液进行切向流过滤；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在使所述发酵液以0.05~0.1 MPa跨模压经过所述中空纤维a之后、收集滤出液之前，还包括补充收获缓冲液使所述外源蛋白充分滤过的步骤。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在使所述滤出液以0.05~0.1 MPa跨模压经过所述中空纤维b、收集截留液之前，还包括补充收获缓冲液使所述色素充分滤过的步骤。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包括：
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，包括：
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，包括：
8.如权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述收获缓冲液为0.01 mol/LTris-HCl缓冲液，pH为5.0。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述中空纤维a的材质为聚偏
10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其特征在于，所述中空纤维a的孔径为750 KD；
...【技术特征摘要】
1.从发酵液中收获外源蛋白的同时去除色素的方法，其特征在于，包括：取两种不同孔径的中空纤维对所述发酵液进行切向流过滤；
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在使所述发酵液以0.05~0.1 mpa跨模压经过所述中空纤维a之后、收集滤出液之前，还包括补充收获缓冲液使所述外源蛋白充分滤过的步骤。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在使所述滤出液以0.05~0.1 mpa跨模压经过所述中空纤维b、收集截留液之前，还包括补充收获缓冲液使所述色素充分滤过的步骤。...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵巧辉，赵枭阳，王齐磊，徐延伟，张豪鹏，李婷，柴丹丹，李桂林，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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