【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肽合成，特别是一种普兰林肽的制备方法。
技术介绍
1、普兰林肽的氨基酸序列为kcntatcatqrlanflvhssnnfgpilptnvgsnty-（nh2），是一种具有复杂氨基酸序列的合成肽，它在糖尿病治疗中显示出了多方面的潜力，能够通过减缓胃排空、通过下丘脑受体促进饱腹感以及抑制胰高血糖素的不适当分泌，帮助调节血糖，还具有提高餐后急性第一阶段胰岛素反应阈值的作用。
2、在生产过程中，固相肽合成法是合成长链肽，如普兰林肽的一种常见策略，然而，随着肽链长度的增加，合成效率往往会降低，同时副反应的发生率增加，这些副反应包括消旋化、肽键错位等，此外，长肽链的合成还可能引起错误的累积，这不仅降低了总体产率，也影响到肽的生物活性，
3、目前的合成技术尝试通过将长肽链分解为较短的段独立合成后再进行合并来提高产量，但这种方法尚未达到理想的效果，常见的做法是将长链简单分为两段进行合成，但这并没有考虑到肽链中氨基酸种类的特性，增加纯化作业的难度；另外在肽链耦合和去除保护基作业的时候通常需要较长的时间，如何缩短合成时间，提高合成效率，也是一个难点。
4、因此，如何根据其氨基酸组成将肽链精确划分成肽段，并对每个段通过精细地控制合成过程、改进合成策略和优化合成条件，以提高每个段的纯度和产率，并有效控制各反应环境；以及如何将这些独立合成的肽段有效合并，从而提高普兰林肽的合成效率和质量，当前研发中亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现
2、本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种普兰林肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
3、s1分段：选择氨基酸序列为kcntatcatqrlanflvhssnnfgpilptnvgsnty-（nh2）的肽链作为目标肽链，编号为seq id no.1；其中，a代表丙氨酸；c代表半胱氨酸；f代表苯丙氨酸；g代表甘氨酸；h代表组氨酸；i代表异亮氨酸；k代表赖氨酸；l代表亮氨酸；n代表天冬酰胺；p代表脯氨酸；q代表谷氨酰胺；r代表精氨酸；s代表丝氨酸；t代表苏氨酸；v代表缬氨酸；y代表酪氨酸；（nh2）代表目标肽链的最后一个酪氨酸的c端以游离酰胺形式存在；
4、将编号为seq id no.1的目标肽链分成肽链一、肽链二、肽链三和肽链四，肽链一的氨基酸序列为kcntatcatq，编号为seq id no.2；肽链二的氨基酸序列为rlanflvhss，编号为seq id no.3；肽链三的氨基酸为nnfgpilp，编号为seq id no.4；肽链四的氨基酸序列为tnvgsnty-（nh2），编号为seq id no.5；
5、将肽链分段的原因如下：在采用固相肽合成法合成肽链的过程中，随着肽链长度的增加，长肽链合成过程中容易发生副反应，如消旋化、肽键错位等，合成的效率往往会降低，合成错误累积的可能性增加，导致总体产率下降；通过将长肽链分为较短的几段，较短的肽段在合成过程中副反应较少，更易于控制反应条件和环境，可以在较高的效率和较低的错误率下单独合成每一段；再通过逐步合并的策略将它们组合起来，可以显著提高整个肽链的生产效率；
6、根据氨基酸的极性、疏水性、反应活性等特性进行考虑，将肽链分成四部分；
7、肽链一 ：结束于谷氨酰胺q，这是一个极性的氨基酸，可以提供较好的溶解性；此外，分割点前的苏氨酸t 为非疏水性氨基酸，有利于在此处断开，因为能提供更好的反应性和纯化便利性，肽链一含有较多的极性和带电氨基酸，可单独优化合成条件以提高产率和纯度；
8、肽链二：在这个肽链中，精氨酸和组氨酸这两种氨基酸具有较强的极性和带正电荷的侧链，另外此段氨基酸含有较多疏水性氨基酸，将这个肽链作为一个单独的段，通过优化合成条件，可以减少副反应；因为两个丝氨酸连续出现，提供了一个相对反应性较高且易于处理的分割点；
9、肽链三：该肽链包含脯氨酸，它能形成刚性的环状结构，影响肽链的整体折叠和结构；导致合成中的特定困难，如影响链的柔韧性和溶解性；另外，苯丙氨酸和异亮氨酸的疏水性使得这部分更难溶解；单独合成和优化脯氨酸含量较高的肽链三，通过优化合成条件，可以最小化合成中的问题，提高整体的合成质量和纯度；肽链三的结尾至肽链四的开始处选择在天冬酰胺和苏氨酸之间进行断开原因在于，苏氨酸的侧链包含羟基，可以作为一个较活跃的位点，在固相合成中易于进行链的延伸或者断开；
10、肽链四：肽链四相对较短，包含的氨基酸之间的化学相容性较好，这使得它可以在较高的合成效率和较低的错误率下作为一个整体进行合成，较短的链长可以更容易地管理和控制合成过程中的反应条件，从而减少副反应的发生，每次分段和后续的连接过程都会增加合成的时间和成本；考虑到肽链四的长度和复杂性适中，将其作为一个整体合成可以更经济高效，减少资源消耗和操作步骤。
11、s2合成前准备：选择rinkamidembha树脂作为固相树脂；将rinkamidembha树脂置于旋转器中，加入二甲基甲酰胺进行旋转作业，使rinkamidembha树脂完全膨胀；然后采用二甲基甲酰胺对膨胀后的rinkamidembha树脂进行清洗；清洗结束后，用过滤或离心的方式去除rinkamidembha树脂，最后使用氮气吹干；
12、依据目标肽链的氨基酸序列包含的氨基酸类型，选择fmoc保护的氨基酸作为合成目标肽链的氨基酸；
13、去除溶液配制：去除溶液由20%的哌啶和80%的二甲基甲酰胺组成，用于去除保护基作业中，去除保护基作业具体为使用去除溶液去除fmoc保护的氨基酸n端的fmoc保护基，然后交替使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷清洗，确保完全去除残留物；最后利用氮气吹干；
14、采用反相高效液相色谱设备进行纯化作业；
15、配置肽合成终止稳定溶液：肽合成终止稳定溶液包括冰醋酸、二甲基甲酰胺和二氯甲烷，按照重量比，冰醋酸:二甲基甲酰胺:二氯甲烷为1-1.1:8:1-1.1；
16、裂解液配制：裂解液1包括二苯甲硅烷 、三甲基硅烷、三氟乙酸、纯水和乙撑二硫醚，按照重量比，二苯甲硅烷:三甲基硅烷:三氟乙酸:纯水:乙撑二硫醚为2.3-2.5:0.05-0.1:90-92:2.4-2.5:0.05-0.1；裂解液2包括三氟乙酸、纯水和三苯甲基三嗪，按照重量比，三氟乙酸:纯水:三苯甲基三嗪为95:2.4-2.5:2.4-2.5；裂解液3为三氟乙酸、纯水和三异丙基硅烷的混合物，按照重量比，三氟乙酸:纯水:三异丙基硅烷为90-92:2.4-2.5:2.4-2.6；
17、利用微波辅助技术，采用微波合成辅助设备，以缩短耦合和去除保护基作业的时间；
18、采用rinkamidembha树脂：rink amide mbha树脂是一种常用的固相合成载体，特别适用于肽的合成，这种树脂的末端带有酰胺功能团，有利于合成带有游离酰胺末端（nh2）的肽本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种普兰林肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤S3中，制备编号为SEQID NO.2的肽链一的具体步骤如下：S3.1制备肽链一粗产品：S3.1.1制备初始肽链一产品：选择Fmoc保护的谷氨酰胺作为首个氨基酸，将Fmoc保护的谷氨酰胺的C端与RinkAmideMBHA树脂通过耦合反应进行连接；然后依次将Fmoc保护的苏氨酸、Fmoc保护的半胱氨酸、Fmoc保护的丙氨酸、Fmoc保护的苏氨酸、Fmoc保护的天冬酰胺、Fmoc保护的半胱氨酸、Fmoc保护的丙氨酸、Fmoc保护的苏氨酸和Fmoc保护的赖氨酸通过耦合反应进行连接，制备初始肽链一产品；
3.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤S4中，制备编号为SEQID NO.3的肽链二的具体步骤如下：
4.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤S5中，制备编号为SEQID NO.4的肽链三的具体步骤如下：S5.1制备肽链三粗产品：S5.1.1制备初始肽链三产品：选择新的RinkAmideMB
5.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤S6中，制备编号为SEQID NO.5的肽链四的具体步骤如下：S6.1制备肽链四粗产品：S6.1.1制备初始肽链四产品：选择新的RinkAmideMBHA树脂，将Fmoc保护的酪氨酸作为首个氨基酸，将Fmoc保护的酪氨酸的C端与RinkAmideMBHA树脂通过耦合反应进行连接；Fmoc保护的苏氨酸、Fmoc保护的天冬酰胺、Fmoc保护的丝氨酸、Fmoc保护的甘氨酸、Fmoc保护的缬氨酸、Fmoc保护的天冬酰胺和Fmoc保护的苏氨酸通过耦合反应的方式进行连接，制备初始肽链四产品；
6.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤S7中，采用真空干燥机进行真空干燥作业，参数设置如下：压力为0.1-1毫巴 ，温度为30°C-40°C；
7.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤S9中，在在离心分离作业中，设置如下：离心速度为10000-15000 rpm，离心温度为4-6°C；
8.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤S10中，在冷冻作业中，冷冻温度为-70至-80°C；在次气相干燥作业中，真空压力为10-20 mTorr，升温速率为1-3°C每分钟；升华温度为-20°C至-25°C。
...【技术特征摘要】
1.一种普兰林肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
2.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤s3中，制备编号为seqid no.2的肽链一的具体步骤如下：s3.1制备肽链一粗产品：s3.1.1制备初始肽链一产品：选择fmoc保护的谷氨酰胺作为首个氨基酸，将fmoc保护的谷氨酰胺的c端与rinkamidembha树脂通过耦合反应进行连接；然后依次将fmoc保护的苏氨酸、fmoc保护的半胱氨酸、fmoc保护的丙氨酸、fmoc保护的苏氨酸、fmoc保护的天冬酰胺、fmoc保护的半胱氨酸、fmoc保护的丙氨酸、fmoc保护的苏氨酸和fmoc保护的赖氨酸通过耦合反应进行连接，制备初始肽链一产品；
3.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤s4中，制备编号为seqid no.3的肽链二的具体步骤如下：
4.如权利要求1所述普兰林肽的制备方法，其特征在于，在步骤s5中，制备编号为seqid no.4的肽链三的具体步骤如下：s5.1制备肽链三粗产品：s5.1.1制备初始肽链三产品：选择新的rinkamidembha树脂，将fmoc保护的脯氨酸作为首个氨基酸，将fmoc保护的脯氨酸的c端与rinkamidembha树脂通过耦合反应进行连接；然后依次将fmoc保护的异亮氨酸、fmoc保护的亮氨酸、fmoc保护的脯氨酸、fmoc保护的甘氨酸、fmoc保护的苯丙氨酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙浩，张瑾，向齐琦，
申请(专利权)人：南京羚诺生物医药技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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