本发明专利技术的人纤维蛋白原的生产方法，采用了有悖于国内常规厂家从组份Ｉ提取、分离人纤维蛋白原的方法，而改从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，生产中采用的Ｓ／Ｄ法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；提取出的产品纯度高达９０％以上，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。本发明专利技术的人纤维蛋白原，生产过程中采用一甘氨酸作为稳定剂，通过延长冻干时间约需６－８天，而一般厂家均为３天左右，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，这时再对制品进行水浴热处理，可以在最短的时间内受热均匀，在达到有效的灭活ＤＮＡ和ＲＮＡ非脂包膜病毒的同时保证了人纤维蛋白原的稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及血液制品领域，特别涉及一种。
技术介绍
背景资料人纤维蛋白原主要由肝脏合成，人体含量约为2. 5 4. 0g/L左右。大部分存在于人体血浆中，仅有不到20%存在于血管外。主要应用于先天性、获得性纤维蛋白原减少症、严重肝脏损伤、肝硬化、DIC以及手术或者产后大出血等的治疗，是临床上用于大出血止血的必备急救药品之一。国内目前虽有几家血液制品厂家具备可生产人纤维蛋白原的资质，但这些厂家在生产过程中采用的都是以血浆离心上清液经低温乙醇分划，生产出的组分I为原料，制得成品。但该工艺主要存在的问题， 一是纯度不高，这些厂家生产出来的制品纯度都在80%以下，产品杂质含量偏多，患者在注射使用时，容易发生不良反应；二是作为风险性较高的血液制品，2005版《中国药典》明确规定人纤维蛋白原制品在生产过程中必须采用二种不同的病毒灭活方法，以减少产品携带病毒的风险，确保制品的安全。对于灭活脂包膜病毒的S/D法，国内、国际已有10多年的成熟经验，是一种较好的，可彻底灭活病毒的方法。但灭活非脂包膜病毒的方法，特别是同时具备灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的能力，国际上还没有一个完整的、成熟的方法，而IO(TC ， 30分钟的干热处理，是目前国内其他厂家采用较多的方法之一。采用该方法，需要考虑产品稳定剂的组成，通用的做法都是添加一种以上的氨基酸作为保护剂。但复合的氨基酸组成却易导致产品加热后发黄、复溶困难、及复溶后有大量的变性蛋白等问题，直接影响这些厂家产品的质量；三是作为DNA非脂包膜病毒的模拟病毒-一PPV病毒，由于其超强的耐热性和耐酸碱性， 一般厂家按照从组份I制造工艺提取出的制品，在对其灭活效果上有很大的难度。我公司的人纤维蛋白原，是以冷沉淀为原料，通过抽提、吸附、离心等制造工艺，并采用国际上先进的离子交换层析技术进行提纯，使得产品的纯度得到了很大的提高。生产过程中采用一种氨基酸作为稳定剂，通过延长冻干时间(约需6天左右，而一般厂家均为3天左右)，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一。这时再对制品进行水浴热处理，可以在最短的时间内受热均匀，达到有效的灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的效果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种纯度高，稳定性高，灭活病毒效果好的。 为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案 —种，其中，步骤为 (1)将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的原料血桨20000 5000rmp的速度进行连续离心分离； (2)沉淀溶解、离心在每公斤步骤(1)所得的沉淀中加入3 8L注射用水，搅拌60 300分钟以上使沉淀完全溶解，调节溶解液的温度到20 4(TC，将其pH值调节到6. 4 7. 4，然后以20000 5000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤； (3)病毒灭活在步骤(2)所得的上清液中添加氯化钙溶液，使所得混合溶液中氯化钙浓度为lmmol/L，并将其温度调节为20 30°C ，然后再添加吐温_80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1%， TNBP最终浓度为0. 3%，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40 100rmp低速搅拌，在24 26。C条件下保温6 8小时； (4)层析精制用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来一并收集； (5)沉淀离心分离在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸，使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为2mol/L，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至0 l(TC ，用离心机对其以20000 5000rmp的速度进行连续离心分离； (6)配制用枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解步骤(5)所得的沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到39 54mmol/L和蔗糖浓度为40 60g/L的范围，搅拌2 6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2. 0 3. 0%，并用0. 5M盐酸溶液或0. 5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6. 4 7. 4 ; (7)除菌过滤用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤； (8)分装、冻干对步骤(7)所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为4 8天，冻干前先对冻干机急速冻结至-40°C以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过35t:，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡； (9)热处理将步骤(8)所得的产品，进行IO(TC ±2°C ， 30分钟的水浴热处理。本专利技术所述的，其中，步骤(1)中在o 4t:的条件下进行离心。 本专利技术所述的，其中，步骤(1)中所采用的原料血浆为冰冻血桨。 本专利技术所述的，其中，对冰冻血浆处理的方法为，在室温下让其自然融化，用75%的酒精进行消毒血浆袋表面，再用20 25t:左右的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用25 35t:的循环水进行循环加热。 本专利技术所述的，其中，步骤(1)离心所得的沉淀保管在-3(TC以下冷库内，将其取出后在室温下破碎成小块，然后再进行步骤(2)。 本专利技术所述的，其中，步骤(2)中用0. 1M醋酸溶液将溶解液的ra值调节为7.0。 本专利技术所述的，其中，步骤(2)中所述的过滤器孔径为1. 0 ii m。 本专利技术所述的，其中，步骤(3)中所得液体在专用的病毒灭活罐内，以70rmp低速搅拌，在25t:条件下保温6小时。 本专利技术所述的，其中，在步骤(7)所述的除菌过滤中，过滤器孔径为0. 22 0. 45 ii m ;步骤(8)中冻干的时间为6天。 本专利技术中所述的枸橼酸盐缓冲液是指氯化钠浓度为120mmol/L和枸橼酸钠浓度为10mmol/L的缓冲液。 本专利技术的优点 1、本专利技术的，采用了有悖于国内常规厂家从组份I提取、分离人纤维蛋白原的方法，而改从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活，能有效的灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒，确保了制品安全；提取出的产品纯度高达90 %以上，杂质蛋白含量低，产品的临床副反应小。 2、本专利技术的人纤维蛋白原，生产过程中采用一甘氨酸作为稳定剂，通过延长冻干时间约需6-8天，而一般厂家均为3天左右，使得产品在冻干过程中温度变化稳定，冻干后产品的结构均一，这时再对制品进行水浴热处理，可以在最短的时间内受热均匀，在达到有效的灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的同时保证了人纤维蛋白原的稳定性。具体实施方式 实施例1 1、血浆收集将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的冰冻原料血浆100L，在室温下自然融化，用75%的酒精进行消毒血浆袋表面，再用25t:的注射用水冲洗血浆袋表面的酒精，破袋，将血浆收集在专用的带有夹层的血浆收集罐，用35°C的循环水进行循环加热，融化好的血浆及时转移到离心专用罐，并控制血浆的温度在4°C ，注入离心机以5000rmp的速度进行连续离心分离，离心的上清液用于人血白蛋白、人免疫球蛋白等的制造，离心的固体成分-一 冷沉淀2. 0kg用于人纤维蛋白原的生产。 2、冷沉淀溶解、离心 将保管于-30°C以下冷库内的冷沉淀2. 0kg拿出本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤为： （１）将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的原料血浆２００００～５０００ｒｍｐ的速度进行连续离心分离； （２）沉淀溶解、离心：在每公斤步骤（１）所得的沉淀中加入３～８Ｌ注射用水，搅拌６０～３００分钟以上使沉淀完全溶解，调节溶解液的温度到２０～４０℃，将其ｐＨ值调节到６．４～７．４，然后以２００００～５０００ｒｍｐ的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤； （３）病毒灭活：在步骤（２）所得的上清液中添加氯化钙溶液，使所得混合溶液中氯化钙浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，并将其温度调节为２０～３０℃，然后再添加吐温－８０和ＴＮＢＰ，使溶液中吐温－８０的最终浓度为１％，ＴＮＢＰ最终浓度为０．３％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以４０～１００ｒｍｐ低速搅拌，在２４～２６℃条件下保温６～８小时； （４）层析精制：用ＤＥＡＥ－６５０Ｍ凝胶层析柱吸附步骤（３）所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用３倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来一并收集； （５）沉淀离心分离：在步骤（４）所收集的液体中添加甘氨酸，使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为２ｍｏｌ／Ｌ，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至０～１０℃，用离心机对其以２００００～５０００ｒｍｐ的速度进行连续离心分离； （６）配制：用枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解步骤（５）所得的沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到３９～５４ｍｍｏｌ／Ｌ和蔗糖浓度为４０～６０ｇ／Ｌ的范围，搅拌２～６小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到２．０～３．０％，并用０．５Ｍ盐酸溶液或０．５Ｍ氢氧化钠溶液将产品的ｐＨ值调节到６．４～７．４； （７）除菌过滤：用灭菌好的过滤器对步骤（６）所得的液体进行除菌过滤； （８）分装、冻干：对步骤（７）所得的液体进行分装，然后进行冻干，冻干时间为４～８天，冻干前先对冻干机急速冻结至－４０℃以下，注意冻干过程前后和整个过程中，制品的温度不能超过３５℃，冻干后制品在真空状态下完全密闭胶塞，在冻干机内部注入无菌空气，使压力达到平衡； （９）热处理：将步骤（８）所得的产品，进行１００℃±２℃，３０分钟的水浴热处理。...
【技术特征摘要】
一种人纤维蛋白原的生产方法，其特征在于，步骤为(1)将病毒检测合格，并且符合国家检疫期规定的原料血浆20000～5000rmp的速度进行连续离心分离；(2)沉淀溶解、离心在每公斤步骤(1)所得的沉淀中加入3～8L注射用水，搅拌60～300分钟以上使沉淀完全溶解，调节溶解液的温度到20～40℃，将其pH值调节到6.4～7.4，然后以20000～5000rmp的速度进行连续离心分离，离心所得上清液用洁净过滤器进行洁净过滤；(3)病毒灭活在步骤(2)所得的上清液中添加氯化钙溶液，使所得混合溶液中氯化钙浓度为1mmol/L，并将其温度调节为20～30℃，然后再添加吐温-80和TNBP，使溶液中吐温-80的最终浓度为1％，TNBP最终浓度为0.3％，将所得液体在专用的病毒灭活罐内，以40～100rmp低速搅拌，在24～26℃条件下保温6～8小时；(4)层析精制用DEAE-650M凝胶层析柱吸附步骤(3)所得的溶液，对通过层析柱的滤液进行收集，吸附结束后，用3倍凝胶体积的枸橼酸盐缓冲液洗涤，将层析柱中的残余的人纤维蛋白原洗涤出来一并收集；(5)沉淀离心分离在步骤(4)所收集的液体中添加甘氨酸，使所得混合溶液中甘氨酸的浓度为2mol/L，待甘氨酸充分溶解完全后，将溶液冷却至0～10℃，用离心机对其以20000～5000rmp的速度进行连续离心分离；(6)配制用枸橼酸钠和蔗糖缓冲液溶解步骤(5)所得的沉淀，使溶解后溶液中枸橼酸钠浓度达到39～54mmol/L和蔗糖浓度为40～60g/L的范围，搅拌2～6小时使沉淀完全溶解，然后调节蛋白浓度到2.0～3.0％，并用0.5M盐酸溶液或0.5M氢氧化钠溶液将产品的pH值调节到6.4～7.4；(7)除菌过滤用灭菌好的过滤器对步骤(6)所得的液体进行除菌过滤；(8)分装、冻干对步...
【专利技术属性】
技术研发人员：金昌燮，鱼湖权，王冰峰，陈向东，石政桓，王玉兵，杨雪瑶，
申请(专利权)人：绿十字中国生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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