【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种编码外切葡聚糖酶的基因、工程菌及其应用。
技术介绍
1、在表达系统方面，人们建立了大肠杆菌、哺乳动物细胞、杆状病毒和酵母四大外源基因表达系统，以期使各种来源的蛋白都能在体外高效表达。其中，哺乳动物表达系统成本高、蛋白产量低，不适于大规模生产的应用。杆状病毒表达系统能将蛋白进行折叠和糖基化修饰，但是其糖基化修饰的位点与天然蛋白有很大的差异。大肠杆菌表达系统则是一种应用非常广泛的表达系统，具有蛋白产量高、周期短和成本低的优点。但容易得到包涵体，而包涵体复性过程烦杂、蛋白回收率低。此外对蛋白糖基化的加工不理想，仅适用于糖基化程度比较低的蛋白的表达。酵母菌是低等真核生物，细胞易培养、生长快，且操作简单。可将表达的蛋白正确加工和修饰，利于蛋白的正确折叠，故非常适合真核蛋白的表达，且弥补了大肠杆菌表达系统缺乏对蛋白加工和修饰的不足。因此酵母被广泛应用于表达系统。
2、地球上每年光合作用的产物主要为植物枝、干和叶等木质纤维素类物质，产量高达1500多亿吨，是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。近年来，利用这些纤维素资源来生产燃料乙醇已成为研究热点。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，传统上分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(即纤维二糖水解酶)和β-葡萄糖苷酶。
3、目前，对中性纤维素酶分子方面的研究主要集中在β-葡萄糖苷酶，鲜见有关外切葡聚糖酶的研究报道。外切葡聚糖酶(即纤维二糖水解酶)作为纤维素酶系的一部分，是作用于结晶纤维素的关键
技术实现思路
1、为解决现有技术中外切葡聚糖酶在中性条件下酶活性低，难以满足工业生产要求的缺陷，本专利技术提供了一种编码外切葡聚糖酶的基因、工程菌及其应用。本专利技术的基因工程菌表达的外切葡聚糖酶的酶活在中性条件下可达50u/l及以上，可为工业应用上构建表达中性纤维素酶的菌株提供参考，具有非常重要的指导意义。
2、本专利技术所述中性条件指的是菌株培养时的ph值为6.5-7.5例如7。
3、本专利技术基因工程菌表达的外切葡聚糖酶的酶活在ph值为6.5-7.5尤其是7的条件下也具有相对较高的活性。
4、为解决上述问题，本专利技术第一方面提供了一种编码外切葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列如seq id no：1-20任一所示。
5、在一些实施方案中，所述编码外切葡聚糖酶的基因的核苷酸序列如seq id no：1、3、4、6、7、8、10、11、15或17所示。
6、在一些实施方案中，所述编码外切葡聚糖酶的基因的核苷酸序列如seq id no：7所示。
7、本专利技术第二方面提供了一种重组表达载体，其包括本专利技术第一方面所述的编码外切葡聚糖酶的基因。
8、在一些实施方案中，所述重组表达载体的骨架质粒为ppic9k。
9、本专利技术第三方面提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌包含本专利技术第一方面所述的编码外切葡聚糖酶的基因，或本专利技术第二方面所述的重组表达载体。
10、在一些实施方案中，所述基因工程菌的宿主为毕赤酵母，例如毕赤酵母gs115。
11、本专利技术第四方面提供了本专利技术第一方面所述的编码外切葡聚糖酶的基因，或本专利技术第二方面所述的重组表达载体，或本专利技术第三方面所述的基因工程菌在生产外切葡聚糖酶中的应用或本专利技术第一方面所述的编码外切葡聚糖酶的基因，或本专利技术第二方面所述的重组表达载体在制备生产外切葡聚糖酶的基因工程菌中的应用。
12、本专利技术第五方面提供了一种生产外切葡聚糖酶的方法，所述方法包括将本专利技术第三方面所述的基因工程菌在适于其生长的培养基中培养，使其发酵，以获得所述外切葡聚糖酶。
13、在一些实施方案中，所述方法包括以下条件的一种或多种：
14、在29-31℃种子培养1-2天，再在29-31℃发酵培养3-5天；
15、所述发酵的过程中使用甲醇，例如1％甲醇诱导；
16、所述培养基为bmgy培养基(buffered minimal glycerol yp medium)或bmmy培养基(bufferedmethanol-complexmedium)。
17、在一些实施方案中，所述种子培养和发酵培养需进行震荡培养，例如控制转速200～250rpm。
18、在一些实施方案中，所述方法还包括发酵后离心获得上清液，以及将所述上清液纯化获得纯化后的外切葡聚糖酶的步骤。
19、本专利技术第六方面提供了一种降解纤维素的方法，将本专利技术第三方面所述的基因工程菌或其表达的外切葡聚糖酶与底物接触，使得所述底物发生降解。
20、本专利技术的积极进步效果在于：
21、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。
22、本专利技术所用试剂和原料均市售可得。
23、本专利技术的积极进步效果在于：
24、本专利技术的基因工程菌表达的外切葡聚糖酶的酶活在ph值为6.5-7.5，尤其是ph值为7的条件下可达50u/l及以上，可为工业应用上构建表达中性纤维素酶的菌株提供参考，具有非常重要的指导意义。
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1.一种编码外切葡聚糖酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO：1-20任一所示。
2.如权利要求1所述的编码外切葡聚糖酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1、3、4、6、7、8、10、11、15或17所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的编码外切葡聚糖酶的基因。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，其骨架质粒为pPIC9K。
5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求1或2所述的编码外切葡聚糖酶的基因，或如权利要求3或4所述的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主为毕赤酵母，例如毕赤酵母GS115。
7.如权利要求1或2所述的编码外切葡聚糖酶的基因，或如权利要求3或4所述的重组表达载体，或如权利要求5或6所述的基因工程菌在生产外切葡聚糖酶中的应用或如权利要求1或2所述的编码外切葡聚糖酶的基因，或如权利要求3或4所述的重组表达载体在制备生产外切葡聚糖酶的基因工程菌中的应用。<...
【技术特征摘要】
1.一种编码外切葡聚糖酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqid no：1-20任一所示。
2.如权利要求1所述的编码外切葡聚糖酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno：1、3、4、6、7、8、10、11、15或17所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，其包括如权利要求1或2所述的编码外切葡聚糖酶的基因。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，其骨架质粒为ppic9k。
5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含如权利要求1或2所述的编码外切葡聚糖酶的基因，或如权利要求3或4所述的重组表达载体。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主为毕赤酵母，例如毕赤酵母gs115。
7.如权利要求1或2所述的编码...
【专利技术属性】
技术研发人员：张琳，张明明，徐敏，刘修才，
申请(专利权)人：上海凯赛生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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