【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程、发酵工程技术、以及酶催化，具体涉及一种组合表达核糖激酶基因及假尿苷-5’-磷酸糖苷酶基因的基因工程大肠杆菌的构建及其在假尿苷发酵生产中的应用。
技术介绍
1、近年来，由于mrna合成技术、分子修饰技术及传递技术的发展，mrna疫苗正逐步走向成熟，在肿瘤、感染性疾病等的防治上有着广泛的应用前景。起初，由于mrna能够激活细胞的先天免疫系统，并且很容易被降解，因此很少在临床上使用。但是最近的研究证实，修饰核苷的使用，特别是修饰尿苷，阻止了细胞识别受体的能力，保证了翻译过程产生足够水平的蛋白质。假尿苷的出现可能与mrna分子的寿命和翻译效率直接相关。2008年，katalinkarikó等人在小鼠实验中发现，含有假尿苷的mrna比未修饰的mrna具有更高的翻译能力，并且可以在动物体内稳定存在，说明含有假尿苷的mrna可以减少先天免疫反应，这对开发mrna疫苗非常有利[katalin karikó等，2008]。
2、目前，研究人员通过已公布的新冠病毒rna序列，就可以直接对翻译靶点蛋白的rna片段进行修饰和编辑(例如：辉瑞采用了n1-甲基-假尿苷修饰的方法)，获得一段可以产生抗原蛋白的rna片段。这段rna注射到体内后，人体的体细胞自身产生大量的抗原蛋白，从而引起特异性的免疫反应，用来防御由sars-cov-2引起的新型冠状病毒感染(covid-19)。假尿苷作为合成mrna疫苗体外转录的重要核苷酸原料之一，当前市场的需求量日益增大。
3、在假尿苷制备方面，目前，只有传统的化学合成法可催
4、因此，本领域迫切需要开发一种高效、安全且专一的假尿苷生产方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种组合表达核糖激酶以及假尿苷-5’-磷酸糖苷酶基因的基因工程大肠杆菌的构建方法及其在假尿苷发酵生产中的应用。
2、本专利技术的又一目的是提供产酶菌株发酵培养以及转化底物生产假尿苷的方法及其应用。
3、在本专利技术的第一方面，提供了一种用于生产假尿苷的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块(gene module)，所述基因模块包括：
4、(a)核糖激酶(rbsk)基因模块，其中所述rbsk基因模块用于以d-核糖为原料，生物合成d-核糖-5-磷酸，并且含有单拷贝或多拷贝的rbsk基因；和
5、(b)假尿苷-5’-磷酸糖苷酶(psug)基因模块，其中所述psug基因模块用于以尿嘧啶为原料，生物合成假尿苷-5-磷酸，并且含有单拷贝或多拷贝的psug基因。
6、在另一优选例中，所述rbsk基因来源于大肠杆菌(escherichia coli)或解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。
7、在另一优选例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌(escherichia coli)k-12mg1655。
8、在另一优选例中，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)xh7。
9、在另一优选例中，所述rbsk基因具有选自下组的序列：
10、(i)如seq id no:2或seq id no:3所示的序列；
11、(ii)与seq id no:2或seq id no:3所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的序列；
12、(iii)在seq id no:2或seq id no:3所示序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-10个)核苷酸的序列；
13、(iv)与(i)-(iv)任一所述序列互补的序列。
14、在另一优选例中，所述rbsk基因具有如seq id no:2或seq id no:3所示的序列。
15、在另一优选例中，所述psug基因来源于大肠杆菌(escherichia coli)、根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)或摩氏摩根菌(morganella morganii)。
16、在另一优选例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌(escherichia coli)k-12mg1655。
17、在另一优选例中，所述psug基因具有选自下组的序列：
18、(i)如seq id no:1、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示的序列；
19、(ii)与seq id no:1、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的序列；
20、(iii)在seq id no:1、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示序列的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30个，更佳地1-10个)核苷酸的序列；
21、(iv)与(i)-(iv)任一所述序列互补的序列。
22、在另一优选例中，所述psug基因具有如seq id no:1、seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示的序列。
23、在另一优选例中，当所述基因模块含有≥2个基因时，有部分或全部基因是串联表达的。
24、在另一优选例中，所述rbsk基因模块或psug基因模块中的基因为串联表达的。
25、在另一优选例中，所述rbsk基因模块和psug基因模块串联表达。
26、在另一优选例中，所述各基因模块中的各个基因受组成型或诱导型启动子的驱动。
27、在另一优选例中，所述各基因模块中的各个基因受诱导型启动子的驱动。
28、在另一优选例中，所述启动子选自下组：t7启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、阿拉伯糖诱导型启动子，或其组合。
29、在另一优选例中，所述表达模块部分或全部整合在基因组上。
30、在另一优选例中，所述表达模块部分或全部位于表达载体上。
31、在另一优选例中，所述表达载体为质粒和/或核酸片段。
32、在另一优选例中，所述表达载体还具有抗性基因元件。
33、在另一优选例中，所述抗性基因选自下组：四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、硫酸链霉素抗性基因，或其组合。
34、在另一优选例中，所述表达载体还具有终止子元件。
35、在另一优选例中，所述表达载体包括pet17b、pet28a、prsfduet-1、pcdfduet-1、petduet-1、pacycduet-1。
36、在另一优选例中，所述工程菌为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于生产假尿苷的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块(gene module)，所述基因模块包括：
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述rbsK基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述rbsK基因具有选自下组的序列：
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述psuG基因具有选自下组的序列：
5.一种生产假尿苷的方法，其特征在于，包括步骤：
6.一种构建如权利要求1所述工程菌的方法，其特征在于，包括步骤：
7.一种如权利要求1所述工程菌的用途，其特征在于，所述工程菌被用于生产假尿苷。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
9.一种如权利要求8所述试剂盒的用途，其特征在于，所述试剂盒用途构建如本专利技术第一方面所述的工程菌。
10.一种用于生产假尿苷的发酵体系，其特征在于，所述发酵体系包
...【技术特征摘要】
1.一种用于生产假尿苷的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块(gene module)，所述基因模块包括：
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述rbsk基因来源于大肠杆菌(escherichia coli)或解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述rbsk基因具有选自下组的序列：
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述psug基因具有选...
【专利技术属性】
技术研发人员：施明安，朱再玲，邵菲，胡晓婧，孙向宇，蔡志刚，
申请(专利权)人：上海新核源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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