【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种用于呼吸道病毒富集测序的建库试剂盒及其使用方法。
技术介绍
1、基因测序技术在病毒检测领域的广泛应用使得病毒检测变得越来越方便、快捷。该技术对于传统检测方法无法准确鉴定的病毒能做到精准鉴别。但宏基因组测序技术在检测人源样本时产生的测序数据中有95％以上是人源序列，而该部分序列对于病毒基因的分析是不必要的，导致大量测序数据量的浪费，同时降低了病毒的检测灵敏度。因此，在进行宏基因组测序前先对病毒进行富集可以提高测序数据利用率，同时也有效提高病毒的检测灵敏度。
2、目前较常用的富集方法主要包括探针杂交技术和多重pcr技术。探针杂交技术可以捕获大片段并进行大规模靶向富集，可避免多重pcr增加的突变及偏好性，且探针的容错性与覆盖性较强。多重pcr技术操作简便、成本低，可以直接设计宏基因组测序文库需要的长度进行扩增，省略片段化环节，简化文库构建流程。然而这些技术同时存在着各自的缺陷。探针杂交技术的探针合成成本较高，探针设计比较复杂，且实验操作复杂、杂交周期较长，快速杂交效果一般较差。对不同浓度的微生物样本杂交捕获效率不同，低浓度的微生物容易丢失。多重pcr技术引物设计也较为复杂，尤其是超多重pcr容易产生引物偏好性，均一性不佳。因此不适合过多微生物富集，一般用于50-100重以下的富集。由于探针杂交和多重pcr技术均是靶向技术需要根据病毒基因组序列设计探针或引物，因此无法对新病毒物种进行检测。同时，这两种靶向富集技术在与广谱的宏基因组测序技术联合使用时由于其本身的靶向性限制甚至降低了宏基因组测序本
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种用于呼吸道病毒富集测序的建库试剂盒及其使用方法第一方面，本专利技术要求保护一种用于对呼吸道病毒进行富集测序的引物集。
2、本专利技术要求保护的用于对呼吸道病毒进行富集测序的引物集，由若干条(一条以上)特异于目标病毒基因组的特异性引物和随机引物组成。
3、所述特异性引物为单引物；因此不需要考虑引物配对的问题，不受到富集重数的限制，可以实现超多重物种富集。并且所述单引物可根据所述目标病毒的基因组进行全基因组覆盖设计。
4、所述目标病毒为肠道病毒a组(eva)、副流感病毒3型(piv3)、呼吸道合胞病毒(rsv)、乙型流感病毒(ifvb)和/或甲型流感病毒(ifva)。
5、所述特异性引物选自如seq id no.1至seq id no.149所示的149个单引物中的全部或部分。
6、进一步地，所述随机引物为n6(seq id no.150)；所述n6表示6个随机碱基，每个碱基均为a或t或c或g。
7、进一步地，所述特异性引物和所述随机引物的摩尔配比可为5:1至10:1(如10:1)。
8、在本专利技术的具体实施方式中，所述特异性引物和所述随机引物的摩尔配比为10:1。
9、进一步地，在所述引物集中，若干条所述特异性引物等摩尔配比。
10、在本专利技术的具体实施方式中，所述引物集由seq id no.1至seq id no.150所示的150个单引物组成。
11、本专利技术所提供的引物集在宏基因组测序中，能够实现所述目标病毒的富集，同时也不影响宏基因组测序对非目标微生物的检测性能。
12、第二方面，本专利技术要求保护一种用于呼吸道病毒富集测序的建库试剂盒。
13、本专利技术要求保护的用于呼吸道病毒富集测序的建库试剂盒，含有前文第一方面中所述的引物集。
14、进一步地，所述试剂盒中还可含有如下中的全部或部分：富集和末端修复缓冲液、富集和末端修复酶溶液、连接缓冲液、连接酶、pcr反应液、磁珠、溶解液；
15、所述富集和末端修复缓冲液为含有逆转录缓冲液、dntp、dtt和tris-hcl的缓冲液；
16、所述富集和末端修复酶溶液为含有rna酶抑制剂、dna polⅰ、takara taq、bst3.0dna聚合酶、superscriptⅱ逆转录酶和t4多聚核苷酸激酶的溶液；
17、所述连接缓冲液为含有tris-hcl、mgcl2、atp和peg8000的缓冲液；
18、所述连接酶溶液为含有t4 dna连接酶的溶液；
19、所述pcr反应液为kapa hifi hotstart readymix pcr kit(kk2631)；
20、所述磁珠为贝克曼库尔特agencourt ampure xp(a63882)磁珠；
21、所述溶解液为无核酸酶水。
22、进一步地，所述富集和末端修复缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：4×逆转录缓冲液，每种dntp终浓度均为0.5-1.5mm的dntp混合液、5-15mm dtt，30-50mm tris-hcl；上述各浓度均为在所述富集和末端修复缓冲液中的终浓度。
23、进一步地，所述富集和末端修复酶溶液组成如下：4-8u/μl rna酶抑制剂，1-5u/μldna polⅰ，0.1-1u/μl takara taq，0.5-1.5u/μl bst 3.0dna聚合酶，10-20u/μlsuperscriptⅱ逆转录酶，0.5-1.5u/μl t4多聚核苷酸激酶的混合溶液；上述各浓度均为在所述富集和末端修复酶溶液中的终浓度。
24、进一步地，所述连接缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：5-15mm mgcl2，1-5mmatp，体积百分含量为5％-20％的peg8000，20-50mm tris-hcl；上述各浓度均为在所述连接缓冲液中的终浓度。
25、进一步地，所述连接酶溶液组成如下：1000-2000u/μl t4 dna连接酶。
26、第三方面，本专利技术要求保护前文第一方面中所述的引物集或前文第二方面中所述的试剂盒在以呼吸道病毒为靶标的宏基因组富集测序中的应用；
27、所述呼吸道病毒(即所述靶标)为肠道病毒a组(eva)、副流感病毒3型(piv3)、呼吸道合胞病毒(rsv)、乙型流感病毒(ifvb)和/或甲型流感病毒(ifva)。
28、第四方面，本专利技术要求保护一种以呼吸道病毒为靶标的宏基因组富集测序文库构建方法。所述呼吸道病毒(即所述靶标)为肠道病毒a组(eva)、副流感病毒3型(piv3)、呼吸道合胞病毒(rsv)、乙型流感病毒(ifvb)和/或甲型流感病毒(ifva)。
29、本专利技术要求保护的以呼吸道病毒为靶标的宏基因组富集测序文库构建方法，包括如下步骤：
30、(a1)采用前文第一方面中所述的引物集对包含所述呼吸道病毒基因组的核酸样本进行扩增；
31、(a2)对(a1)所得的扩增产物进行宏基因组测序文库构建。
32、进一步地，所述方法可包括如下步骤：
33、(b1)从待测样本中提取总核酸；所述待测样本中携本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于对呼吸道病毒进行富集测序的引物集，由若干条特异于目标病毒基因组的特异性引物和随机引物组成；
2.根据权利要求1所述的引物集，其特征在于：所述随机引物为N6；所述N6表示6个随机碱基，每个碱基均为A或T或C或G。
3.根据权利要求1或2所述的引物集，其特征在于：所述特异性引物和所述随机引物的摩尔配比为5:1至10:1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的引物集，其特征在于：在所述引物集中，若干条所述特异性引物等摩尔配比。
5.一种用于呼吸道病毒富集测序的建库试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-4中任一所述的引物集。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有如下中的全部或部分：富集和末端修复缓冲液、富集和末端修复酶溶液、连接缓冲液、连接酶溶液、PCR反应液、磁珠、溶解液；
7.权利要求1-4中任一所述的引物集或权利要求5或6所述的试剂盒在以呼吸道病毒为靶标的宏基因组富集测序中的应用；
8.一种以呼吸道病毒为靶标的宏基因组富集测序文库构建方法，所述
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
10.一种以呼吸道病毒为靶标的宏基因组富集测序方法，包括如下步骤：按照权利要求8或9所述方法构建得到宏基因组测序文库，然后上机进行测序。
...【技术特征摘要】
1.一种用于对呼吸道病毒进行富集测序的引物集，由若干条特异于目标病毒基因组的特异性引物和随机引物组成；
2.根据权利要求1所述的引物集，其特征在于：所述随机引物为n6；所述n6表示6个随机碱基，每个碱基均为a或t或c或g。
3.根据权利要求1或2所述的引物集，其特征在于：所述特异性引物和所述随机引物的摩尔配比为5:1至10:1。
4.根据权利要求1-3中任一所述的引物集，其特征在于：在所述引物集中，若干条所述特异性引物等摩尔配比。
5.一种用于呼吸道病毒富集测序的建库试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-4中任一所述的引物集。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含...
【专利技术属性】
技术研发人员：马珍子，黄涛，林永权，宫艳萍，吴红龙，
申请(专利权)人：天津华大医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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