【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学及作物育种，具体涉及一种鉴定辣椒核雄性不育基因的kasp分子标记及其应用。
技术介绍
1、茄科辣椒(capsicum annuum l)属一年或多年生作物，是世界上最主要的蔬菜作物。辣椒属于常异花授粉作物，具有抗性好、品质优、产量高等明显的杂种优势。因辣椒杂种优势利用价值较高，优良杂交种比常规种一般可增产30％-50％。利用辣椒雄性不育系选育优良杂交种是解决人工去雄难题的重要途径，因此，雄性不育研究一直倍受国内外诸多学者的高度重视。
2、随着分子生物学的快速发展，分子标记辅助选择成为育种的重要手段，近年发展起来的竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配对snp以及indel位点进行精准的双等位基因分型。kasp的特异性引物通常采用24bp-26bp，会有更高的特异性，对比常规酶切电泳准确率高；只需常规pcr扩增，所需时间短；无需昂贵的双色标记探针，灵活性超强；最低的dna样本需求，无需全基因组扩增；快速高效，可以高通量检测大量样本，是目前国际上主流的基因分型方法之一。
3、中国专利技术专利cn109913575 a公开了一种鉴定辣椒cms雄性不育恢复基因的kasp分子标记、试剂盒及其应用，该专利是针对辣椒细胞质雄性不育，是三系配套。现有技术中，对辣椒细胞核雄性不育两用系进行育性鉴定的方法还未见报道。
技术实现思路
1、针对现有技术
2、为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、第一方面，提供一种鉴定辣椒核雄性不育基因的kasp分子标记，kasp分子标记的snp位点对应辣椒5号染色体上第25862908个核苷酸位点c突变为a，其由正向引物cap91-2-f1、正向引物cap91-2-f2和反向引物cap91-2-r的引物组扩增snp位点得到；
4、正向引物cap91-2-f1的核酸序列为seq id no.1所示；
5、正向引物cap91-2-f2的核酸序列为seq id no.2所示；
6、反向引物cap91-2-r的核酸序列为seq id no.3所示。
7、第二方面，提供一种鉴定辣椒核雄性不育基因的试剂盒，其包括：正向引物cap91-2-f1、正向引物cap91-2-f2、反向引物cap91-2-r、荧光探针和pcr反应试剂；
8、正向引物cap91-2-f1的核酸序列为seq id no.1所示；
9、正向引物cap91-2-f2的核酸序列为seq id no.2所示；
10、反向引物cap91-2-r的核酸序列为seq id no.3所示；
11、荧光探针为两种不同的荧光基团；正向引物cap91-2-f1、正向引物cap91-2-f2和反向引物cap91-2-r用于扩增kasp分子标记。
12、进一步地，荧光基团分别为fam荧光基团及hex荧光基团。
13、进一步地，pcr反应试剂包括2x parms pcr mix和去离子水。
14、第三方面，提供一种kasp分子标记或试剂盒在辣椒苗期对两用系群体的育性基因型进行鉴别中的应用。
15、进一步地，利用kasp分子标记或试剂盒进行鉴别的方法，包括以下步骤：
16、(1)将两种不同的荧光探针分别标记正向引物cap91-2-f1和cap91-2-f2，得到荧光标记的cap91-2-f1和cap91-2-f2；
17、(2)提取待测辣椒幼苗的基因组dna；
18、(3)将荧光标记的正向引物cap91-2-f1和cap91-2-f2、反向引物cap91-2-r、基因组dna以及pcr反应试剂混合，进行pcr反应，以扩增kasp分子标记；
19、(4)对扩增产物进行荧光检测，检测到引物cap91-2-f1对应的荧光信号时，判定为辣椒纯合可育植株；检测到引物cap91-2-f2对应的荧光信号时，判定为辣椒纯合不育植株；若同时检测到两种荧光信号时，判定为辣椒杂合可育植株；
20、步骤(1)和(2)之间无顺序上的先后。
21、进一步地，pcr反应的反应程序为：94℃15分钟；94℃20秒，65℃1分钟，10个循环，每循环下降0.8℃；94℃20秒，57℃1分钟，28个循环；57℃1分钟。
22、本专利技术的有益效果为：
23、(1)本专利技术利用bsa-seq的方法，定位到一个新的控制辣椒细胞核雄性不育的基因，并依据该基因的突变位点，开发了与该辣椒细胞核雄性不育(gms)育性相关联的kasp分子标记。可以直接在苗期用于辣椒育性基因型鉴定，利用该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响等问题。
24、(2)本专利通过开发与辣椒细胞核雄性不育基因相关的kasp分子标记，可在苗期鉴别不育株与可育株的基因型。在转育过程中，于苗期对f2植株的育性基因型进行早期检测鉴定，可有效淘汰基因型为msms的可育株，筛选出基因型为msms的可育株，直接用于不育系的转育，可减少人力、物力、财力投入。该标记也可应用于两用系的杂交组合选配及杂交制种，在苗期对两用系群体的育性基因型进行早期鉴别，可有效淘汰50％可育株(msms)，选留的50％不育株(msms)直接用于杂交组合选配及杂交制种，可减少50％定植数量，省去花期鉴定、拔除50％可育株的工作。
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1.一种鉴定辣椒核雄性不育基因的KASP分子标记，其特征在于，所述KASP分子标记的SNP位点对应辣椒5号染色体上第25862908个核苷酸位点C突变为A，其由正向引物Cap91-2-F1、正向引物Cap91-2-F2和反向引物Cap91-2-R的引物组扩增所述SNP位点得到；
2.一种鉴定辣椒核雄性不育基因的试剂盒，其特征在于，包括：正向引物Cap91-2-F1、正向引物Cap91-2-F2、反向引物Cap91-2-R、荧光探针和PCR反应试剂；
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团分别为FAM荧光基团及HEX荧光基团。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括2X PARMS PCRMix和去离子水。
5.权利要求1所述的KASP分子标记或权利要求2～4任一项所述的试剂盒在辣椒苗期对两用系群体的育性基因型进行鉴别中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，利用KASP分子标记或试剂盒进行鉴别的方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的应用，其特征
...【技术特征摘要】
1.一种鉴定辣椒核雄性不育基因的kasp分子标记，其特征在于，所述kasp分子标记的snp位点对应辣椒5号染色体上第25862908个核苷酸位点c突变为a，其由正向引物cap91-2-f1、正向引物cap91-2-f2和反向引物cap91-2-r的引物组扩增所述snp位点得到；
2.一种鉴定辣椒核雄性不育基因的试剂盒，其特征在于，包括：正向引物cap91-2-f1、正向引物cap91-2-f2、反向引物cap91-2-r、荧光探针和pcr反应试剂；
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团分别为fam荧光基团及hex荧光基团。
...【专利技术属性】
技术研发人员：孟雅宁，严立斌，张哲，张红肖，李欣欣，
申请(专利权)人：河北省农林科学院经济作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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