一种登革病毒IgG抗原制备方法技术

技术编号：42508174 阅读：7 留言：0更新日期：2024-08-22 14:24

本发明专利技术涉及病毒技术领域，具体涉及一种登革病毒IgG抗原制备方法，包括如下步骤：(1)将含登革病毒的液体加入PEG6000和NaCl，搅拌，离心，弃上清，得到病毒沉淀物A；(2)、将病毒沉淀物A进行重新悬浮，离心，收集上清液；(3)、将步骤(2)得到的上清液进行蔗糖密度梯度离心，收集登革病毒IgG抗原；先在含登革病毒的液体加入PEG6000和NaCl，利用PEG6000‑NaCl溶液、搅拌以及离心，将登革热病毒沉淀，弃上清，去除杂质，然后将收集的病毒沉淀物A重新悬浮，再次离心，收集上清液采用蔗糖密度梯度离心法离心，收集登革病毒IgG抗原，制备的登革病毒IgG抗原浓度高、杂质低。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及病毒，具体涉及一种登革病毒igg抗原制备方法。

技术介绍

1、实时rt-pcr被认为是登革热病毒感染最常用的技术，然而此分子方法依赖于样本采集的时间、适当的样本采集技术和样本中足量的病毒rna载量。迫切需要可靠的血清学检测作为分子技术的补充工具，以提高实验室诊断能力，特别是对于实时rt-pcr无法检测出病毒载量的个体。在登革热爆发大流行期间，登革热病人诊断、人群免疫水平和流行病学监测迫切需要可靠、方便和成本效益高的诊断方法，如血清学检测。

2、间接elisa法检测登革热病毒特异性人igg抗体的检测试剂采用重组蛋白作为检测抗原,而非完整的病毒蛋白，容易与其他病毒，比如乙脑病毒(japanese encephalitisvirus,jev)、寨卡病毒(zika virus,zikv)和基孔肯亚病毒(chikungunya virus,chikv)，发生交叉反应，最受关注的问题是假阴性和假阳性的发生率较高。而采用完整登革热病毒蛋白的igg elisa具有高灵敏度和特异性强的优点。

3、目前，为获得大量的病毒抗原蛋白，常采用悬浮细胞培养方法对病毒进行繁殖，然后采用纯化方法纯化，以获得去除核酸杂质的高浓度的完整病毒抗原蛋白。然而，还未有对于完整登革热病毒抗原蛋白的大规模制备方法的相关报道。

技术实现思路

1、因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种登革病毒igg抗原制备方法，可以获得高浓度的、无杂质的登革病毒igg抗原。

2、为此，本专利技术提供了如下的技术方案：

3、一种登革病毒igg抗原制备方法，包括如下步骤：

4、(1)、将含登革病毒的液体加入peg6000和nacl，搅拌，离心，弃上清，得到病毒沉淀物a；

5、(2)、将所述病毒沉淀物a进行重新悬浮，离心，收集上清液；

6、(3)、将步骤(2)得到的上清液进行蔗糖密度梯度离心，收集登革病毒igg抗原。

7、可选的，所述步骤(1)中，每1升含登革病毒的液体中添加11.1-44.4g的nacl和20-120g的聚乙二醇6000，优选的，22.2g的nacl和60g聚乙二醇6000；

8、和/或，所述步骤(1)中，所述搅拌的条件为4℃下搅拌10-18小时，优选的为12小时；

9、和/或，所述步骤(1)中，所述离心的条件为4℃以6000-10000转/分钟离心20-60分钟，优选的为8000转/分钟离心30分钟。

10、可选的，所述步骤(2)中，所述离心的条件为4℃以9000-12000转/分钟离心10-40分钟，优选的为以10000转/分钟离心20分钟。

11、可选的，所述步骤(3)中，采用的蔗糖密度梯度溶液为由上至下依次包括质量浓度为10-20％、30-45％、48-60％的蔗糖溶液；优选的为由上至下依次包括质量浓度为15％、30-45％、50％的蔗糖溶液。

12、可选的，所述步骤(3)中，所述上清液的体积为16-20ml，10-20％蔗糖溶液的体积为3-5ml，30-45％蔗糖溶液的体积为10-15ml，48-60％的蔗糖溶液的体积为2-4ml；优选的，所述上清液的体积为18ml，10-20％蔗糖溶液的体积为4ml，30-45％蔗糖溶液的体积为13ml，50％的蔗糖溶液的体积为3ml；

13、和/或，所述步骤(3)中，蔗糖密度梯度离心中离心的条件为4℃以18000-24000转/分的速度进行12-18小时的离心；优选的，蔗糖密度梯度离心中离心的条件为4℃以20000转/分的速度进行12-18小时的离心。

14、可选的，所述含登革病毒的液体的制备方法，包括如下步骤：大规模培养细胞，接种登革病毒扩增繁殖，收集病毒，得到登革病毒的液体。

15、可选的，所述大规模培养细胞步骤中，向c6/36细胞悬浮液中加入细胞培养微载体，搅拌培养；

16、和/或，所述接种登革病毒扩增繁殖步骤中，待大规模培养细胞步骤中，附着细胞的细胞培养微载体沉淀，弃掉培养基，然后接种登革病毒，培养；

17、和/或，所述收集病毒步骤中，将所述登革病毒扩增繁殖后得到的培养液进行过滤，将得到的滤液进行离心，收集上清液。

18、可选的，所述大规模培养细胞步骤中，在加入细胞培养微载体前，c6/36细胞悬浮液的细胞浓度为1×105-1×107细胞/毫升；优选的，c6/36细胞悬浮液的细胞浓度为1×106细胞/毫升；

19、和/或，所述大规模培养细胞步骤中，细胞培养微载体的浓度为5g/500ml-20g/500ml；优选的，细胞培养微载体的浓度为10g/500ml；

20、和/或，所述大规模培养细胞步骤中，细胞培养微载体选择cytodex；

21、和/或，所述登革病毒扩增繁殖步骤中,所采用的培养基中不添加青链霉素和牛胎血清

22、和/或，所述登革病毒扩增繁殖步骤中，登革病毒接种的浓度为0.1-1感染复数(multiplicity of infection,moi)；

23、和/或，所述登革病毒扩增繁殖步骤中，所述培养的条件为28℃、无co2的密封条件中培养1-3小时，然后补充培养基，然后继续在28℃、无co2下搅拌培养5-7天；优选的，28℃、无co2的密封条件中培养2小时，然后补充培养基，然后继续在28℃、无co2下密封条件下搅拌培养6天。

24、可选的，所述收集病毒步骤中，所述离心的条件为4℃下以6000-9000转/分钟离心20-60分钟；优选的，所述收集病毒步骤中，所述离心的条件为4℃下以8000转/分钟离心30分钟。

25、一种所述的登革病毒igg抗原制备方法制备得到的登革病毒igg抗原。

26、本专利技术技术方案，具有如下优点：

27、1、本专利技术提供的一种登革病毒igg抗原制备方法，包括如下步骤：(1)、将含登革病毒的液体加入peg6000和nacl，搅拌，离心，弃上清，得到病毒沉淀物a；(2)、将所述病毒沉淀物a进行重新悬浮，离心，收集上清液；(3)、将步骤(2)得到的上清液进行蔗糖密度梯度离心，收集登革病毒igg抗原；在上述方法中，首先在含登革病毒的液体加入peg6000和nacl，利用peg6000-nacl溶液、搅拌以及离心，将登革病毒沉淀，弃上清去除杂质，然后将收集的病毒沉淀物a重新悬浮，再次离心，收集上清液，上清液中富集有登革病毒，去除含杂质的沉淀，然后采用蔗糖密度梯度离心法离心，登革病毒igg抗原在蔗糖溶液中形成白色沉淀条带(band)，而登革病毒的核酸则留在上清液中，收集登革病毒igg抗原，上述的纯化方法，使得制备的登革病毒igg抗原浓度高、核酸杂质低。

28、2、本专利技术提供的一种登革病毒igg抗原制备方法，采用的蔗糖密度梯度溶液为由上至下依次包括质量浓度为15％、30-45％、50％的蔗糖溶液，在上述范围内，能够获得更高浓度的登革病毒igg抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，每1升含登革病毒的液体中添加11.1-44.4g的NaCl和20-120g的聚乙二醇6000，优选的，22.2g的NaCl和60g聚乙二醇6000；

3.根据权利要求1或2所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述离心的条件为4℃以9000-12000转/分钟离心10-40分钟，优选的为以10000转/分钟离心20分钟。

4.根据权利要求1或2所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用的蔗糖密度梯度溶液为由上至下依次包括质量浓度为10-20％、30-45％、48-60％的蔗糖溶液；优选的为由上至下依次包括质量浓度为15％、30-45％、50％的蔗糖溶液。

5.根据权利要求4所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述上清液的体积为16-20ml，10-20％蔗糖溶液的体积为3-5ml，30-45％蔗糖溶液的体积为1

6.根据权利要求1-5任一项所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述含登革病毒的液体的制备方法，包括如下步骤：大规模培养细胞，接种登革病毒扩增繁殖，收集病毒，得到登革病毒的液体。

7.根据权利要求6所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述大规模培养细胞步骤中，向C6/36细胞悬浮液中加入细胞培养微载体，搅拌培养；

8.根据权利要求7所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述大规模培养细胞步骤中，在加入细胞培养微载体前，C6/36细胞悬浮液的细胞浓度为1×105-1×107细胞/毫升；优选的，C6/36细胞悬浮液的细胞浓度为1×106细胞/毫升；

9.根据权利要求6-8任一项所述的登革病毒IgG抗原制备方法，其特征在于，所述收集病毒步骤中，所述离心的条件为4℃下以6000-9000转/分钟离心20-60分钟；优选的，所述收集病毒步骤中，所述离心的条件为4℃下以8000转/分钟离心30分钟。

10.一种由权利要求1-9任一项所述的登革病毒IgG抗原制备方法制备得到的登革病毒IgG抗原。

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【技术特征摘要】

1.一种登革病毒igg抗原制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的登革病毒igg抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，每1升含登革病毒的液体中添加11.1-44.4g的nacl和20-120g的聚乙二醇6000，优选的，22.2g的nacl和60g聚乙二醇6000；

3.根据权利要求1或2所述的登革病毒igg抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述离心的条件为4℃以9000-12000转/分钟离心10-40分钟，优选的为以10000转/分钟离心20分钟。

4.根据权利要求1或2所述的登革病毒igg抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，采用的蔗糖密度梯度溶液为由上至下依次包括质量浓度为10-20％、30-45％、48-60％的蔗糖溶液；优选的为由上至下依次包括质量浓度为15％、30-45％、50％的蔗糖溶液。

5.根据权利要求4所述的登革病毒igg抗原制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述上清液的体积为16-20ml，10-20％蔗糖溶液的体积为3-5ml，30-45％蔗糖溶液的体积为10-15ml，48-60％的蔗糖溶液的体积为2-4ml；优选的，所述上清液的体积为18ml，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛战球，郭中屹，
申请(专利权)人：江西省胸科医院江西省第三人民医院，
类型：发明
国别省市：

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