【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于糖基化蛋白质组学领域，具体涉及一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法。
技术介绍
1、糖基化是最常见、最丰富的蛋白质翻译后修饰之一，哺乳动物细胞中一半以上的蛋白质会发生糖基化。此外，糖蛋白具有重要的临床诊断价值，目前用于疾病诊断的蛋白质疾病标志物大多为糖蛋白。n-糖基化是一种重要的糖基化类型，n-糖基化修饰发生在蛋白质特定的氨基酸序列n-x！-s/t上(其中x表示除脯氨酸以外的任何氨基酸)，聚糖通过天冬酰胺残基的nh2与蛋白质连接。n-糖基化对于蛋白质折叠、蛋白质稳定、蛋白质运输十分重要，并且还参与细胞信号传导、细胞粘附以及精子与卵母细胞相互作用等多种生物过程。糖尿病、癌症、阿尔茨海默病、自身免疫性疾病和炎症等多种疾病的发生与发展都受到n-糖蛋白的调控或伴随着n-糖基化的异常。因此，深入研究n-糖基化对于理解蛋白质功能以及疾病的发病机理具有重要意义。然而，在全蛋白酶解消化后的肽段中，糖肽的比例仅为2％～5％。由于存在大量非糖基化修饰肽段的干扰，直接将样品送入质谱检测、进行糖蛋白的鉴定非常困难。因此，在质谱检测前首先需要进行糖肽富集，实现糖肽和非糖肽的分离，减少非糖基化肽段对质谱检测过程的干扰，从而提高质谱检测的灵敏度。
2、由于糖基化修饰蛋白在总蛋白中的占比较低，糖肽富集是糖基化蛋白质组学研究的关键步骤。目前，常见的n-糖肽富集方法有凝集素亲和层析法(lectin affinitychromatography,lac)、亲水相互作用色谱法(hydrophilic interactionchrom
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于填补现有n-糖基化肽段富集方法的灵敏度低的缺陷，提供一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法；该方法开发了一种适用于微量样品、步骤简单、操作方便、高特异性的、具有普适性的n-糖基化肽段富集新方法，可以实现微量样品糖基化肽段的富集和鉴定。
2、本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：
3、本专利技术保护一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，所述方法以磁珠为基体材料，通过在一个管子中进行富集操作，及凝集素与糖肽的高亲和力实现糖基化肽段的高灵敏富集。
4、在具体的实施方案中，所述方法包括如下步骤：(1)在中性ph的有机溶液中，磁珠捕获凝集素并将其以非共价结合的方式包被在磁珠表面；(2)洗涤未与磁珠结合的凝集素；(3)肽段样品与包被凝集素的磁珠孵育，从而特异性地富集糖基化肽段；(4)洗涤未与磁珠结合的非糖肽后，加入n-糖酰胺酶f(n-glycanase f,pngase f)将n-糖基化肽段从磁珠上释放，在此过程中，糖基化修饰位点天冬酰胺会转化为天冬氨酸，发生质量偏移(+0.984da)；(5)肽段在酸性条件下洗脱，进行质谱检测；(6)质谱数据检索时，添加脱酰胺化的可变修饰(天冬酰胺转化为天冬氨酸，asn-＞asp，分子量+0.984da)，得到n-糖基化蛋白质组学数据。
5、在具体的实施方案中，步骤(1)中磁珠与凝集素比例在10:1至1:2(m/m)之间，具体为10:1、5:1、2:1、1:1、1:2等。
6、在具体的实施方案中，步骤(1)中使用的试剂为乙醇、乙腈等同属性有机溶剂中的一种，并且有机溶剂浓度范围≥50％，如可以选择50％乙醇溶液，60％乙醇溶液、80％乙醇溶液，50％乙腈溶液，60％乙腈溶液、80％乙腈溶液等。
7、在具体的实施方案中，步骤(1)中的凝集素为刀豆蛋白a(cona)、小麦胚芽凝集素(wga)、蓖麻凝集素(rca)等凝集素中的一种或几种凝集素的混合。
8、在具体的实施方案中，步骤(1)中的磁珠可以是羧基或者氨基修饰磁珠。
9、在具体的实施方案中，步骤(2)中使用的试剂为乙醇、乙腈等同属性有机溶剂中的一种，并且有机溶剂浓度范围为≥50％，如可以选择50％乙醇溶液，60％乙醇溶液、80％乙醇溶液，50％乙腈溶液，60％乙腈溶液、80％乙腈溶液等。
10、在具体的实施方案中，步骤(3)中的磁珠包被凝集素与肽段的比例在20:1至1:1之间，具体如20:1、10:1、5:1、2:1、1:1等。
11、在具体的实施方案中，步骤(3)中的肽段样品量在10μg至200μg之间。
12、在具体的实施方案中，步骤(3)中的孵育条件为大于50％的有机溶剂，温度为室温，时间为3-12小时。
13、在具体的实施方案中，步骤(4)中使用的洗涤非糖肽试剂为乙醇、乙腈等同属性有机溶剂中的一种，并且有机溶剂浓度范围为≥50％，如可以选择50％乙醇溶液，60％乙醇溶液、80％乙醇溶液，50％乙腈溶液，60％乙腈溶液、80％乙腈溶液等。
14、在具体的实施方案中，步骤(4)中pngase f处理时间为3-12小时，温度为25-37℃。
15、在具体的实施方案中，步骤(5)中洗脱条件为酸性(ph<3)。
16、与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：(1)是一种普适的，能够特异性富集不同类型样品中n-糖基化肽段的方法。(2)适用于微量样品(如10μg肽段)的n-糖基化肽段富集。(3)全程在一个管子中进行，避免样品转移、使用不同材料造成的样品严重损失等问题，实现了在单个离心管中的糖肽富集。(4)凝集素通过非共价的方式与磁珠偶联，此过程凝集素活性不受影响，具有较强的富集效率。(5)磁珠具备磁性，结合自动化磁珠仪器，可实现自动化操作，提高样品制备效率。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种基于凝集素包被磁珠的包被的微量糖基化肽段富集方法，用于糖基化蛋白质组学分析，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)在中性pH的有机溶液中，磁珠捕获凝集素并将其以非共价结合的方式包被在磁珠表面；(2)洗涤未与磁珠结合的凝集素；(3)肽段样品与包被凝集素的磁珠孵育，从而富集糖基化肽段；(4)洗涤未与磁珠结合的非糖肽后，加入N-糖酰胺酶F将N-糖基化肽段从磁珠上释放，在此过程中，糖基化修饰位点天冬酰胺会转化为天冬氨酸，发生质量偏移；(5)肽段在酸性条件下洗脱，进行质谱检测；(6)质谱数据检索时，添加脱酰胺化的可变修饰，得到N-糖基化蛋白质组学数据。
2.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(1)中磁珠与凝集素质量比在10:1至1:2之间。
3.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)中使用的试剂为乙醇或乙腈，并且有机溶剂浓度范围≥50％。
4.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(1)
5.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(1)中的磁珠为羧基或者氨基修饰磁珠。
6.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(3)中的磁珠包被凝集素与肽段的比例在20:1至1:1之间。
7.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(3)中的肽段样品量在10μg至200μg之间。
8.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(4)中使用的洗涤非糖肽试剂为乙醇或乙腈，并且有机溶剂浓度范围为≥50％。
9.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(4)中PNGase F处理时间为3-12小时，温度为25-37℃。
10.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(5)中洗脱条件为酸性，具体为pH<3。
...【技术特征摘要】
1.一种基于凝集素包被磁珠的包被的微量糖基化肽段富集方法，用于糖基化蛋白质组学分析，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)在中性ph的有机溶液中，磁珠捕获凝集素并将其以非共价结合的方式包被在磁珠表面；(2)洗涤未与磁珠结合的凝集素；(3)肽段样品与包被凝集素的磁珠孵育，从而富集糖基化肽段；(4)洗涤未与磁珠结合的非糖肽后，加入n-糖酰胺酶f将n-糖基化肽段从磁珠上释放，在此过程中，糖基化修饰位点天冬酰胺会转化为天冬氨酸，发生质量偏移；(5)肽段在酸性条件下洗脱，进行质谱检测；(6)质谱数据检索时，添加脱酰胺化的可变修饰，得到n-糖基化蛋白质组学数据。
2.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(1)中磁珠与凝集素质量比在10:1至1:2之间。
3.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)中使用的试剂为乙醇或乙腈，并且有机溶剂浓度范围≥50％。
4.根据权利要求1所述的一种基于凝集素包被磁珠的微量糖基化肽段富集方法，其特征在于，步骤(1)中的凝集素为刀...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭雪江，祝辉，郭曰帅，司徒成昊，李妍，霍子安，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：
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