一种固定化蒜氨酸酶及超声场酶促反应制备大蒜素方法技术

本发明专利技术涉及一种固定化蒜氨酸酶及超声场酶促反应制备大蒜素方法。大蒜是药食同源植物，大蒜素（油）是大蒜的重要活性成分，大蒜素（油）具有抗菌消炎，抗肿瘤、防癌抗癌，抗血小板聚集，提高机体免疫力，降胆固醇、预防心血管疾病和降血压等多种生理和保健功能。大蒜素（油）具有接近生蒜的香气和辛辣味，风味完整，纯天然，安全，健康，广泛应用于食品咸味添加剂、保健食品、食用调和油等。本发明专利技术集成固定化酶技术和超声波场强酶促化技术，利用固定化蒜氨酸酶转化蒜氨酸，提高蒜氨酸酶利用率、稳定性、活力和酶促反应速度，大大提高蒜氨酸转化率和大蒜素得率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于食品、医药
，应用于功能食品、保健品、医药、饲料等行业。
技术介绍
大蒜为百合科葱属植物蒜(Allium sativum L.)的鳞茎，大蒜素(油)是从大蒜中提取的一类水不相溶的挥发性有机硫化物，是大蒜中主要生物活性成分。大蒜素的化学名为三硫化二丙烯(二烯丙基三硫化物)，分子式为C6H1QS3，结构式为CH2 =CHCH2-S-S-S-CH2CH = C^，分子量为178. 33。纯品大蒜素为无色油状物，具有大蒜异味，比重1. 112(20°C ) 大蒜素具有抗菌消炎，抗肿瘤、防癌抗癌，抗血小板聚集，提高机体免疫力，降胆固醇、预防心血管疾病和降血压等多种生理和保健功能。其作用表现在①大蒜素能抑制或杀死多种致病性真菌和细菌，被誉天然抗生素，尤其对多种皮肤病和脚气有效。大蒜素中的二硫醚、三硫醚能穿过致病菌的细胞膜进入细胞，使菌体蛋白酶巯基失活，破坏致病菌的正常新陈代谢，抑制细菌的生长繁殖。②大蒜素可改善微循环，增加外周血流量，抑制凝血因子的活性，有明显的抗动脉粥样硬化作用，对高胆固醇血症引起的主动脉粥样硬化具有较好的保护作用，具有保护心血管系统和降血脂作用。③预防肿瘤作用。大蒜素能抑制和干扰多种化学性致癌物，阻断致癌物对正常细胞产生的诱变过程(如苯并芘的致癌过程)，参与细胞遗传物质DNA正常的分裂和修复过程，能够预防肺癌、肝癌、食道癌的发生；大蒜素中二烯丙基硫是非常重要的抗癌因子，通过防止致癌物形成，干扰致癌物的活化，增强解毒性能，避免正常细胞向癌细胞的转化，进一步阻止肿瘤细胞的形成。④大蒜素可以縮短凝血时间，预防血栓形成。⑤大蒜素可诱导人淋巴细胞转化，增加T淋巴细胞转化，增加巨噬细胞和淋巴细胞的功能活动，增强机体免疫功能。大蒜素广泛用于功能食品、临床医药，还可作为天然饲料添加剂，不仅能诱食助消化、提高机体免疫力、抑菌杀菌及防霉驱虫，而且还具有改善畜产品品质和风味的作用。 研究表明新鲜大蒜中没有游离大蒜素，只有它的前体物质一蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-allyl-L-cysteine sulfoxide ;alliin)，约占大蒜总鲜重的0. 25% ;蒜氨酸以稳定无臭的形式存在于大蒜中，当大蒜加工或受到物理机械破碎后，大蒜中的蒜氨酸酶(allinase)被激活，催化分解蒜氨酸成为大蒜素，因此在大蒜素形成过程中，蒜氨酸和蒜氨酸酶起着重要作用(如附图1)。 图1蒜氨酸转化生成大蒜素的反应过程 为提高大蒜素得率，便于分离纯化产物，本专利技术将蒜氨酸酶固定化技术和超声场结合应用，在适当超声场条件下，由于超声波的空穴和高频震荡作用，反应液中底物(蒜氨酸)和产物分子(大蒜素)以较高的频率震动，提高固定化蒜氨酸酶与底物和反应物的接触次数，促使底物和产物分子迅速进入和排出载体，从而使固定化酶活力增大，酶促反应速度增加，大大提高了蒜氨酸的转化效率和大蒜素的得率。
技术实现思路
本专利技术提供了，该技术方法利用尼龙网(尼龙布)固定化蒜氨酸酶，在适当的超声场作用下催化转化蒜氨酸(或大蒜泥)生成大蒜素，提高蒜氨酸转化率和大蒜素得率。 本专利技术的技术方案 本专利技术是，固定化酶特征为蒜氨酸酶被化学键合固定在尼龙网(尼龙布)，酶促反应制备大蒜素的特征为采用适当的超声波场连续式(或间歇式)处理固定化蒜氨酸酶与底物溶液，提高固定化蒜氨酸酶活力和酶促反应速度，提高蒜氨酸转化率和大蒜素得率。本专利技术是通过以下技术方法实现的(l)新三乙基肟四氟化硼的制备；(2)尼龙网活化；(3)蒜氨酸酶固定化；(4)固定化蒜氨酸酶的超声波场酶促反应生成大蒜素；(5)大蒜素的提取与精制。 本专利技术的技术效果 大蒜破碎后可释放蒜氨酸酶，该酶可催化蒜氨酸转化生成大蒜素，但其反应时间长、得率低。本专利技术是将酶固定化技术与超声场酶促反应技术结合集成，通过戊二醛交联方式使蒜氨酸酶与尼龙网(尼龙布)结合固定，以化学键结合较为稳定；在适当超声场条件下，由于超声波的空穴和高频震荡作用，反应液中底物(蒜氨酸)和产物分子(大蒜素)以较高的频率震动，提高固定化蒜氨酸酶与底物和反应物的接触次数，促使底物和产物分子迅速进入和排出载体，从而使固定化酶活力增大，酶促反应速度增加，大大提高了蒜氨酸的转化效率和大蒜素的得率。附图说明附图1蒜氨酸转化生成大蒜素的反应过程附图2固定化蒜氨酸酶膜转化大蒜素装置示意图。具体实施例方式本专利技术通过以下5个步骤具体实施 (1)新三乙基肟四氟化硼制备在45-5(TC时，将500mL 10% (W/V)环氧氯丙烷无水乙醚液慢慢滴加到200mL 5% (W/V)三氟化硼无水乙醚溶液中，同时搅拌，回流l_3h后，常温下继续搅拌反应3-5h，即生成三乙基肟四氟化硼沉淀。用无水乙醚洗涤沉淀3-5次，将沉淀溶入二氯甲烷中配制10% (W/V)三乙基肟四氟化硼二氯甲烷溶液，备用。 (2)尼龙网活化25t:条件下将尼龙网(100目-200目)浸在0. 5mol/L HC1溶液中活化30min，取出后用蒸馏水冲至洗出液呈中性；将此尼龙网浸入新合成的10% (W/V)三乙基肟四氟化硼二氯甲烷溶液中，反应7-15min后，依次用二氯甲烷和三氧六环各清洗2-5min;室温下与10% (W/V)己二胺甲醇溶液反应3_5h，用去离子水浸泡清洗尼龙网10-15h，并中间换液3-5次，滤纸吸干；用无水甲醇浸泡清洗尼龙网15-20min，最后尼龙网与2. 5%-5% (W/V)戊二醛溶液反应20-50min后，无水乙醇清洗尼龙网数次，滤纸吸干。 (3)蒜氨酸酶固定化在4t:条件冰箱内，将预处理过的尼龙网浸入一定量的蒜氨酸酶溶液中，固定化3-15h ;取出后依次用0. 2mol/L的甘氨酸、0. 2mol/L NaCl溶液和0. lmol/L磷酸盐缓冲液(pH = 7. 0)清洗尼龙网，即得固定化蒜氨酸酶膜；将此固定化酶膜 浸于O. lmol/L磷酸盐缓冲液(pH = 7.0)中，4。C保存备用。 (4)将固定化蒜氨酸酶膜固定于生物流化床反应器内，按照附图2所示连接各单 元设备及管路，底物蒜氨酸溶液(或大蒜提取液；P朋.6，Fe离子激活剂浓度10mmol/L)经 循环泵进入生物流化床反应器，在30-5(TC，20-200W超声波场强作用下固定化蒜氨酸酶催 化底物转化产生大蒜素，经连续3-5个循环后，料液从出液口放出，用于提取、精制大蒜素。 图2固定化蒜氨酸酶膜转化大蒜素装置示意图 (5)水蒸汽蒸馏法(或超临界C02萃取法或溶剂萃取法)提取大蒜素 蒸馏法取料上锅，压力0. 12MPa，时间1. 5h，蒸汽流量100kg/500L. h，油水分离器分离大蒜素(油)后，加入硅胶脱水和活性炭脱色精制得成品。 超临界C02萃取法萃取压力20MPa、萃取温度25°C 、静态萃取时间75min、动态萃 取时间45min，总萃取率约61. 5% 。 溶剂萃取法采用真空50% _70%乙醇作提取剂(真空度7. 73X 105Pa)提取效果 好。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化蒜氨酸酶及超声场酶促反应制备大蒜素方法，其特征是利用三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂、以戊二醛作为交联剂，以尼龙网（尼龙布）作为支撑材料固定化蒜氨酸酶，利用适当超声场催化转化蒜氨酸（或大蒜泥）生成大蒜素，提高蒜氨酸转化率和大蒜素得率。

【技术特征摘要】
一种固定化蒜氨酸酶及超声场酶促反应制备大蒜素方法，其特征是利用三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂、以戊二醛作为交联剂，以尼龙网(尼龙布)作为支撑材料固定化蒜氨酸酶，利用适当超声场催化转化蒜氨酸(或大蒜泥)生成大蒜素，提高蒜氨酸转化率和大蒜素得率。2. 根据权利要求1所述的一种固定化蒜氨酸酶及超声场酶促反应制备大蒜素方法，其特征在于固定化蒜氨酸酶的制备方法，利用三乙基肟四氟化硼作烷基化试剂、以戊二醛作为交联剂，以100-200目尼龙网(尼龙布...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成涛，王静，曹雁平，孙宝国，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]