【技术实现步骤摘要】
【】本专利技术属于代谢工程，是指构建一种高效共利用玉米秸秆水解物中的葡萄糖、木糖、对香豆酸和阿魏酸等木质素降解物的罗氏真养产碱杆菌及其发酵合成聚羟基丁酸酯。
技术介绍
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技术介绍
1、利用清洁、可再生的生物质资源，合成生物材料、生物化学品和生物燃料等高附加值产品是一种清洁和经济的生物炼制途径。木质纤维素是自然界最丰富的可再生资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素三部分组成。通过热化学、物理化学或生物预处理等方法，纤维素和半纤维素能降解成可溶性还原糖如葡萄糖和木糖，木质素则会降解成芳香化合物如对香豆酸和阿魏酸等，然后通过化学或生物方法合成高附加值产品。目前的生物质的生物转化主要集中于利用木质纤维素水解液中的糖类，其中的木质素尚没有得到有效利用；这不仅造成了生物质资源的浪费，木质素副产物也造成了环境污染。因此构建能全利用生物质组分的微生物菌株，将使清洁高效利用生物质资源成为可能。
2、罗氏真养产碱杆菌(cupriavidus necator h16)是一种兼性化能自养细菌，能进行自养和异养生长。基因组的测序和注释分析表明该菌存在完整的2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸(ed)途径、磷酸戊糖途径(ppp)和β-酮己二酸途径，这为糖代谢途径的构建奠定了基础。罗氏真养产碱杆菌是合成聚羟基丁酸酯(phb)的模式细菌，其phb积累能达到细胞干重的80％以上。phb是一种高分子聚合物，具有优异的材料性能，已被广泛应用于医药、农业、环保等领域。利用廉价的玉米秸秆合成phb有利于降低成本，实现phb大规模化生产。同时随着
技术实现思路
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技术实现思路
1、【专利技术目的】
2、本专利技术提供了一种生物质组分全利用的罗氏真养产碱杆菌及其应用，为利用廉价的木质纤维素生物质合成高附加值产品奠定了基础。
3、本专利技术的第一个目标是提供一种共代谢葡萄糖、木糖、对香豆酸和阿魏酸等木质素降解物的罗氏真养产碱杆菌工程菌。
4、以罗氏真养产碱杆菌dsm428为出发菌株，通过敲除转录抑制因子nagr、点突变磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统(pts)的膜组分nage以及适应性实验室进化，实现菌株对葡萄糖的利用；接着将木糖异构酶xyla、木酮糖激酶xylb和木糖转运蛋白xyle基因分别置换基因组上的乳酸脱氢酶ldh和乙酸激酶acka基因，构建完整的木糖代谢途径；最后构建外源的依赖辅酶a的β氧化途径来实现对香豆酸和阿魏酸等木质素降解物的利用，经过上述递进的菌株改造，获得能同时利用葡萄糖、木糖、香豆酸和阿魏酸等木质素降解物的工程菌株reh06。
5、本专利技术的第二个目标是利用所述的工程菌，以玉米秸秆水解液为底物发酵生产phb。
6、工程菌株reh06先在含葡萄糖的矿质培养基中活化,再以2％的接种量转接于含有玉米秸秆水解物的矿质培养基中，在30℃、200rpm条件下，摇瓶发酵培养72h。发酵期间对各时间段的上清液进行取样并适当稀释，通过高效液相色谱法测定底物的浓度。发酵结束后收集菌体，并用蒸馏水离心清洗两次，65℃烘干至恒重，测量菌体干重。然后将菌体进行100℃酯化处理，利用气相色谱检测phb产量。
7、【本专利技术的技术方案】
8、本专利技术的上述技术方案与现有技术相比具有以下优点：
9、本专利技术是在罗氏真养产碱杆菌中基因改造nag操纵子、葡萄糖的适应性进化、整合木糖相关代谢基因、以及构建和优化外源的依赖辅酶a的β氧化途径，从而实现工程菌株能在葡萄糖、木糖和香豆酸和阿魏酸等木质素降解物为碳源的液体培养基中生长。同时将获得的工程菌株reh06，在含有玉米秸秆水解物的矿质培养基中发酵生产phb。通过代谢工程改造微生物，共利用木质素纤维素全组分合成高附加值化学品，对发展绿色循环经济具有重要意义。
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1.一种生物质组分全利用的罗氏真养产碱杆菌，其特征是：以罗氏真养产碱杆菌DSM428为出发菌株，敲除转录抑制因子nagR、点突变nagE和适应性实验室进化，实现葡萄糖的代谢；接着将xylAB和xylE基因分别置换基因组上的ldh和ackA基因，实现木糖的代谢；最后通过重组质粒表达依赖辅酶A的β氧化途径，实现对香豆酸和阿魏酸的代谢，获得所述的生物质组分全利用的工程菌；同时利用玉米秸秆水解物葡萄糖、木糖和木质素降解物发酵生产聚羟基丁酸酯。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是：基因nagE突变后的核苷酸序列如Seq IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是：启动子PphaC1的核苷酸序列如Seq ID NO.2所示，置换的ldh的xylAB基因的核苷酸序列如Seq ID NO.3所示，置换的ackA的xylE基因的核苷酸序列如Seq ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是：依赖辅酶A的β氧化途径的构建，需要表达外源基因：ech的核苷酸序列如Seq ID NO.5所示；vdh的核苷酸序列如Seq ID
5.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是：利用含有葡萄糖、木糖和木质素降解物的玉米秸秆水解物发酵生产聚羟基丁酸酯。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是：发酵温度28-32℃，发酵时间是60-78h。
...【技术特征摘要】
1.一种生物质组分全利用的罗氏真养产碱杆菌，其特征是：以罗氏真养产碱杆菌dsm428为出发菌株，敲除转录抑制因子nagr、点突变nage和适应性实验室进化，实现葡萄糖的代谢；接着将xylab和xyle基因分别置换基因组上的ldh和acka基因，实现木糖的代谢；最后通过重组质粒表达依赖辅酶a的β氧化途径，实现对香豆酸和阿魏酸的代谢，获得所述的生物质组分全利用的工程菌；同时利用玉米秸秆水解物葡萄糖、木糖和木质素降解物发酵生产聚羟基丁酸酯。
2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是：基因nage突变后的核苷酸序列如seq idno.1所示。
3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是：启动子pphac1的核苷酸序列如seq id no.2所示，置换的ldh的xylab基因的核苷酸序列如seq id...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩业君，翁彩红，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：
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