【技术实现步骤摘要】
【】本专利技术涉及分子标记，特别涉及一种快速检测猪肠病毒g型的检测试剂、试剂盒及其应用。
技术介绍
0、
技术介绍
1、猪肠病毒g(enterovirus g,ev-g)是一种常见的猪肠道病原体，为小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)、无囊膜的单股正链rna病毒，依据基因型可分为g1-g20。该病毒基因组长度约为7.5kb，结构包括5'utr、结构蛋白、非结构蛋白和3'utr，其中3'utr和5'utr最保守。ev-g在大多数养猪国家中流行，各年龄段猪群均易感，通常表现无症状感染，感染幼年仔猪可能引起肠道或中枢神经等临床症状，当与其他肠道病毒共同致病机体时可引起呕吐，腹泻等肠道症状。yang等人从中国安徽省(中部地区)及上海市(东部地区)分别采集猪群临床样品进行rt-pcr检测发现ev-g对仔猪更易感。杨春杰等人对2017～2018年广西地区ev-g的流行情况进行了检测，表明广西地区同样存在ev-g的流行。
2、近年来，规模养殖场猪病错综复杂，混合感染导致疫病的临床症状复杂多样，临床诊断猪病难度增加。ev-g是一种常见的猪肠道病原体，在猪病临床病料中可经常检测到该病毒，同时发现ev-g常与其他病毒混合感染。ev-g引起的疾病临床症状多种多样，与其他多种疾病有相似之处，难以从临床上进行判断，因此急需建立一种效果更好的诊断方法。ev-g的突变率高导致其各个基因型间差异非常大，本研究前期将ev-g进行多序列比对，发现3'utr最保守，其次是5'utr基因，由于3'
3、ev-g现有的检测技术包括病毒分离鉴定、普通pcr、rt-qpcr及宏基因组测序等。然而病毒分离鉴定操繁琐，耗时长；普通pcr的灵敏度低，特异性较差；rt-qpcr对检测设备与检测环境的要求高；宏基因组测序对仪器设备要求高，价格昂贵；这些检测技术都难以应用于现场检测，因此不适用于养殖场等这些偏远或设备简陋的地区。
4、重组酶介导等温核酸扩增(raa)技术的原理是重组酶与特异性dna引物结合识别靶标dna，在单链dna结合蛋白和dna聚合酶作用下发生链置换，恒温条件下短时间内即可获得大量扩增核酸产物，在raa扩增体系中加入反转录体系，可直接进行rt-raa扩增。crispr/cas是细菌和古细菌中一种适应性免疫系统，crispr由一系列短的高度保守的正向重复序列(repeats)与长度相似的间隔序列(spacers)间隔交互排列组成。cas12a蛋白属于2类v型crispr效应蛋白，是在单链向导rna引导下与靶dna特定位点结合并切割的核酸内切酶。将rt-raa技术与crispr/cas12a系统相结合建立一种新的核酸检测方法，该方法的原理为cas12a蛋白在crrna介导下与raa产生的靶标dna形成三元复合体，该复合体可切割体系中任意单链dna，体系内含有荧光报告基团的单链dna(ssdna)报告分子被切割后释放荧光基团，通过收集荧光信号即可检测靶标dna。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速高效的特点，可用于对临床样本中的dna进行快速、简便、即时的检测。
技术实现思路
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技术实现思路
1、鉴于上述内容，有必要提供一种快速检测猪肠病毒g型的检测试剂、试剂盒及其应用，本专利技术通过将rt-raa技术与crispr/cas12a系统相结合，并优化条件，成功的特异性检测了猪肠病毒g型。该方法具有可常温反应、耗时短、特异性强、灵敏度高及重复性好等优势。
2、为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种快速检测猪肠病毒g型的检测试剂，所述检测试剂包括raa扩增引物、荧光ssdna和crrna；
4、所述raa扩增引物的核酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示；
5、所述荧光ssdna的序列为5’-fam-ttatt-bhqi-3’；
6、所述crrna的核酸序列如seq id no.3所示。
7、进一步的，所述检测试剂的最低检测下限为1.56×100copies/μl。
8、进一步的，所述检测试剂的cas12a蛋白浓度为250nm，crrna浓度为250nm。
9、一种非诊断目的检测或者辅助检测猪肠病毒g型核酸的方法，所述方法包括如下步骤：采用权利要求1所述的检测试剂对待测样本进行检测，并根据检测结果判定所述待测样本中是否含有猪肠病毒g型的核酸，具体为：如检测试剂能在荧光下显色，则所述待测样品中含有所述猪肠病毒g型的核酸；如检测试剂不能在荧光下显色，则所述待测样品中不含有所述猪肠病毒g型的核酸。
10、进一步的，检测的条件包括：温度为37℃。
11、本专利技术具有如下有益效果：
12、1、本申请成功建立了一种快速检测ev-g的rt-raa与cirspr/cas12a相结合的技术手段。该方法在37℃左右，1个半小时内可以完成整个操作与检测，且结果直接通过在蓝光下肉眼观察判定，检测限可达到100copies/ul，具有温度低、耗时短、特异性强、灵敏度高及重复性好等优势，适用于条件较差的非实验室场所检测，具有良好的应用前景。
13、2、本申请的方法分为两步进行，第一步进行raa扩增为获取大量目的基因片段，扩增片段一般设在80～500bp，raa扩增片段过长易导致扩增效率降低，因此在设计引物时，扩增片段为100～300bp最佳。第二步为配置cirspr/cas12a检测体系，在体系中加入荧光报告分子ssdna，可通过荧光定量pcr仪器或者恒温荧光信号收集装置(zb-32-1)观察荧光值或荧光曲线来判定结果，也可置于蓝光凝胶成像仪下观察体系是否发出绿色荧光直接判定结果。在该方法的建立中，其浓度优化和重复性试验中，需要荧光数值来进行比较和计算则使用到荧光定量pcr仪器检测得到具体荧光数值；而其他试验可通过荧光曲线来判定结果的则使用恒温荧光信号收集装置(zb-32-1)，该仪器体积小、集检测功能与检测结果输出一体化、操作简单及效率高等优势可应用于养殖场等偏远地区；而蓝光凝胶成像仪下肉眼直接观察结果更为方便，但该仪器无法得到荧光值与荧光曲线，只能判定是否为阳性或阴性，适用于资源匮乏、条件落后且需要检测大量样品的非实验室检测场所。本研究通过对三种仪器的使用也为后续其他相关研究或检测中对仪器选择上提供参考。
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1.一种快速检测猪肠病毒G型的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括RAA扩增引物、荧光ssDNA和crRNA；
2.根据权利要求1所述的猪肠病毒G型检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的最低检测下限为1.56×100copies/μL。
3.根据权利要求1所述的猪肠病毒G型检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的Cas12a蛋白浓度为250nM，crRNA浓度为250nM。
4.一种非诊断目的检测或者辅助检测猪肠病毒G型核酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：采用权利要求1所述的检测试剂对待测样本进行检测，并根据检测结果判定所述待测样本中是否含有猪肠病毒G型的核酸，具体为：如检测试剂能在荧光下显色，则所述待测样品中含有所述猪肠病毒G型的核酸；如检测试剂不能在荧光下显色，则所述待测样品中不含有所述猪肠病毒G型的核酸。
5.根据权利要求4所述的非诊断目的检测或者辅助检测猪肠病毒G型核酸的方法，其特征在于，检测的条件包括：温度为37℃。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测猪肠病毒g型的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括raa扩增引物、荧光ssdna和crrna；
2.根据权利要求1所述的猪肠病毒g型检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的最低检测下限为1.56×100copies/μl。
3.根据权利要求1所述的猪肠病毒g型检测试剂，其特征在于，所述检测试剂的cas12a蛋白浓度为250nm，crrna浓度为250nm。
4.一种非诊断目的检测或者辅助检测猪...
【专利技术属性】
技术研发人员：覃绍敏，刘金凤，欧阳康，杨丽华，许力士，秦树英，韦珊珊，马玲，陈凤莲，林俊，韦珏，陆晨阳，杨磊，彭娜，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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