一种检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测血液中乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。本发明专利技术是将磁性免疫层析技术和异硫氰酸荧光素系统引入到乙肝核心抗体检测中。该试纸条是将包被膜、结合了乙肝核心抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。本发明专利技术具有操作简便，反应时间快、灵敏度高，特异性好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检验领域，特别是涉及。
技术介绍
乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起，HBV是一种包含部分双链环状DNA基因组的 包膜病毒，属于肝DNA病毒科。当病毒在肝细胞中复制时，可以干扰肝脏的功能，随即免疫 系统激活产生一系列特异的反应以对抗并根除传染性因素。作为一种病理性损伤的结果， 肝脏发生炎症。持续的HBV感染导致的严重的病理学结果包括慢性肝脏功能不全，肝硬化 和肝细胞癌(HCC)。 乙肝核心抗体是最早在HBV感染后出现的标志抗体，效价高、持续时间长，甚至终 身不消失，所以是流行病学调查的良好标志。 一般认为，高滴度核心抗体提示HBV在复制， 低滴度阳性表示既往曾感染过HBV。 目前的HBcAb诊断技术主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层 析法(胶体金或乳胶颗粒法)、PCR法，这些方法都有各自的特点和适用对象。 ELISA法是目前临床血液筛查中普遍使用检测技术，但是ELISA试验操作程序复 杂，容易出现假阳性或假阴性结果，且灵敏度较低。CLIA与ELISA方法类似，只是灵敏度提 高了一些，并没有根本解决ELISA存在的问题，并且二者都存在操作繁琐，反应时间长的问 题，而且都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及温箱等复杂设备，而且不能单人份检测，进一 步限制了他们在一些基层医院、诊所的应用。 近几年国内外出现了以胶体金或乳胶颗粒为代表的快速检测试纸条，但是由于结 果是肉眼目视观察，容易受观察者主观判断的影响，灵敏度低，结果准确度也不高，检测窗 口期较长。 PCR方法，需要很高的试验工作环境和条件(无菌操作间，超净工作台)和大量的 仪器设备(培养箱，离心机，PCR仪等)，并且操作极其复杂，需要受过严格专业训练的人员 操作，且试验周期很长，不适合用于临床检测用。 磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一 种单人份快速定量检测技术。是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金， 乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对 生物样品的定量检测数据。该技术与传统技术相比具有下述优势a.所用磁性检测仪器采 用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；b.灵敏度比各类目测快 速诊断法高10-100倍；c.线形范围在4个数量级浓度范围内呈线性；d.超顺磁性纳米微粒 由聚合物包被，不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等) 简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量 的缺点。 目前常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，没有外加磁场的情况下不具 有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰， 大大方便了标记过程，标记简便，重复性好。 将异硫氰酸荧光素系统引入磁性免疫层析中，既提高了检测方法的灵敏度，又提 供了一种通用技术平台，增加了工艺的通用性，减少了系统因素的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是将磁性免疫层析技术与异硫氰酸荧光素系统联合应用在HBcAb 免疫分析中。将抗FITC抗体共价偶联于超顺磁颗粒上，将FITC化HBcAb与之混合之后作 为检测流动相，将HBcAg包被于硝酸纤维素膜上制成检测线作为捕获固相，按照常规免疫 层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，在实现高灵敏度检 测的同时又能达到快速检测的目的，可以避免前述几种检测方法的不足，又综合了前述几 种方法的优势可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以给出定量结果，测量仪器简单 可靠，操作简便，方便实用。 为达到上述的目的，本专利技术的技术方案如下本专利技术是将包被膜、结合HBcAb的磁 颗粒垫、样品垫和吸水垫依次相互交错2mm粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封 膜而制成，其中所述的包被膜上预包被有HBcAb检测线，以及FITC化牛血清白蛋白的质控 线。 选用的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫 为纤维素膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所述 的样品垫处理液是含有1% _5%明胶和0. 1% -1%的聚乙烯醇(PVP)，以及0. 01-0. 2%吐 温-20 (Tween-20)的0. 02M， pH7. 0-7. 6的Tris盐缓冲液。 检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤 A、磁颗粒的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥 珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将抗FITC抗体标记到磁颗粒上，再将FITC联结到HBcAb 上，然后以l : 5-1 : 20的比例(体积比)将FITC化HBcAb与抗FITC抗体磁颗粒混合， 并确保抗FITC抗体磁颗粒过量； B、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25 iU/cm-50 ill/cm的量喷涂于磁颗 粒垫上；C、包被膜的制备使用包被缓冲液分别将HBcAg以及FITC化BSA稀释到0. 5_2mg/ m的浓度，使用定量喷液装置分别将两者以0. 5-1. 0cm的间隔于硝酸纤维素膜上，晾干后于 封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加入干燥剂封存备用； D、样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出 25-35t:烘干8小时； E、试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样 品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试 纸条。所述的步骤A包括以下三步 1)抗FITC抗体磁颗粒的制备使用含有0. 2% Tween-20的50mM pH4. 5-5. 0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，加入EDC和NHS使二者终浓度均为20mmol，室温反应1小时，使用 含有O. 1% Tween-20的50mM，pH4. 5-5. 0的醋酸钠缓冲液充分洗涤磁颗粒后加入抗FITC抗 体使抗FITC抗体与磁颗粒的分子比例为5 : 1(摩尔比)，室温反应3小时，加入含有0. 5% BSA的0. 02M， pH7. 0-7. 6的PBS室温封闭30分钟，洗涤磁颗粒，使用含有1 % PVP， 1 %明胶， 1% Tween-20，5X蔗糖的50mM pH8. 2-9. 0的硼酸保存缓冲液复溶磁颗粒，4保存备用； 2) FITC-HBcAb的制备将HBcAb对0. 02M， pH7. 0-7. 6的PBS 4透析过夜，调整浓 度为2mg/ml，将FITC使用二甲基亚砜(DMSO)溶解，终浓度为50mM，以20 : 1的分子比例 向抗体溶液中加入所需量的FITC溶液，室温反应1小时，对O. 02M PBS 4。C透析过夜，加入 等体积甘油后-2(TC保存备用； 3)FITC-HBcAb与抗FITC抗体磁颗粒的混合，以0. 5 y 1/mg磁颗粒的量向抗FITC 抗体磁颗粒溶液中加入FITC-HBcAb，充分混匀后使用保存缓冲液以1 : 5-1 : 20的比例 (体积比)将混合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。 所述的步骤B中，磁颗粒的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是将包被膜、结合了乙肝核心抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错２ｍｍ地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有乙肝核心抗体检测线和质控线。

【技术特征摘要】
一种检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于该试纸条是将包被膜、结合了乙肝核心抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有乙肝核心抗体检测线和质控线。2. 根据权利要求1所述的检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所 述的包被膜制备是使用0. 05mM pH9. 4_9. 8的CB分别将乙肝核心抗原以及异硫氰酸荧光素 化牛血清白蛋白稀释到0. 5-2mg/ml的浓度，使用定量喷液装置分别将二者以0. 5_1. 0cm的 间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加入 干燥剂封存备用。3. 根据权利要求1所述的检测乙肝核心抗体的磁性免疫层析试纸条，其特征在于所 述的磁颗粒垫制备是选用合适的磁颗粒，使用碳二亚胺和琥珀酰亚胺共价偶联的方式将抗 异硫氰酸荧光素抗体标记到磁颗粒上；将异硫氰酸荧光素连接于乙肝核心抗体上，并以适 当比例与抗异硫氰酸荧光素抗体磁颗粒混合，确保抗异硫氰酸荧光素抗体磁颗粒过量；将 制备好的磁颗粒用定量喷液装置以25 i...

【专利技术属性】
技术研发人员：任超，应希堂，胡国茂，郑金来，唐宝军，张坤，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]