【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药技术和分子生物学领域，涉及一种人类胰腺癌相关的血清microrna标志物及一种新的胰腺癌诊断方法。
技术介绍
1、在消化系统常见肿瘤中，胰腺癌的恶性程度较高，患者5年生存率不足8%，有“癌症之王”之称。临床诊断困难，中位生存期短，预后差为显著特点。
2、胰腺癌早期诊断十分困难，主要治疗手段包括手术与放化疗，传统的生物标志物在胰腺癌诊断及靶标治疗上未能取得较好的效果。因此，寻找新的生物标志物对于胰腺癌的早期诊断及治疗非常重要。
3、微小核糖核酸（microrna，mirna）是一类长度很短的非编码单链小分子rna，长度约为19~23nt，由一段具有发夹环结构的长度为70~80个核酸的mirna前体剪切后生成，能够通过与靶mrna特异性的碱基配对引起靶mrna的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后表达的调控。虽然目前胰腺癌的发病机制尚未完全明确，但近年来已有多项研究发现microrna在胰腺癌中异常表达，并参与胰腺癌的生物调控，发挥致癌或抑癌基因的作用，有望成为新的生物标志物。
技术实现思路
1、针对现有技术，本专利技术的目的是提供一组胰腺癌相关血清microrna标志物及胰腺癌诊断方法，提供的胰腺癌相关血清microrna标志物在胰腺癌早期、中期和晚期（ⅰ期、ⅱ期和ⅲ期）都具有较高的诊断准确度，针对本专利技术提出的胰腺癌microrna标志组合进行胰腺癌检测，可对是否患有胰腺癌做出准确判断，进一步提高胰腺癌诊断效果，提升诊断价值。p>
2、为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术提供了胰腺癌相关血清microrna标志物，其特征在于，所述标志物由hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764构成；其中：hsa-mir-125的序列为tccctgagaccctttaacctgtga，hsa-mir-155的序列为ttaatgctaatcgtgataggggtt，hsa-mir-21的序列为tagcttatcagactgatgttga，hsa-mir-31的序列为aggcaagatgctggcata，hsa-mir-3683的序列为tgcgacattggaagtagtatca，hsa-mir-4764的序列为tggatgtggaaggagttatct。
4、本专利技术还提供了一种胰腺癌诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
5、s1. 抽取被检测人员的外周血放入分离胶采血管中，经离心处理后得到外周血血清，经过抽提纯化后，得到含有总rna的待测血清样本；
6、s2. 用real-time pcr方法检测待测血清样本中胰腺癌相关血清microrna标志物hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764在血清中的相对表达量；real-time pcr检测使用的pcr检测试剂中含有针对上述胰腺癌相关血清microrna标志物的引物；
7、s3. 将步骤s2测出的δct值输入如下判别公式：
8、综合判断值=-3.513+0.042*δct hsa-mir-125 +0.449*δct hsa-mir-155 -0.774*δct hsa-mir-21 +0.159*δct hsa-mir-31 -0.539*δct hsa-mir-3683 +0.751*δct hsa-mir-4764；综合判断值≥0时，为阳性，患胰腺癌的风险较高；综合判断值＜0时，为阴性，患胰腺癌的风险较低。
9、所述pcr检测试剂中含有的引物具体如下：标志物hsa-mir-125（seq id no.1）的上游引物hsa-mir-125-f的序列为tccctgagaccctttaacctg（seq id no.7）；标志物hsa-mir-155（seq id no.2）的上游引物hsa-mir-155-f的序列为ttaatgctaatcgtgatagg（seqid no.8）；标志物hsa-mir-21（seq id no.3）的上游引物hsa-mir-21-f的序列为tagcttatcagactgatgt（seq id no.9）；标志物hsa-mir-31（seq id no.4）的上游引物hsa-mir-31-f的序列为aggcaagatgctggcata（seq id no.10）；标志物hsa-mir-3683（seq idno.5）的上游引物hsa-mir-3683-f的序列为tgcgacattggaagtagtat（seq id no.11）；标志物hsa-mir-4764（seq id no.6）的上游引物hsa-mir-4764-f的序列为tggatgtggaaggagtta（seq id no.12）；上述6个标志物的通用下游引物universal rp的序列为cagtgcagggtccgaggt（seq id no.13）。
10、为了方便临床检测使用，可以将在本专利技术胰腺癌诊断方法步骤s2中使用的pcr检测试剂和工具制备成试剂盒，所述pcr检测试剂可以由含有针对胰腺癌相关血清microrna标志物（hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764）的引物试剂，以及阳性质控品、阴性质控品、taq酶、dntps、pcr缓冲液、mgcl、tagman探针、荧光定量pcr参比染料等试剂构成，其中，含有引物的试剂是针对本专利技术胰腺癌标志物而特别设计的，其他试剂均可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
11、为了评估本专利技术胰腺癌相关血清microrna标志物组合（即hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764组合）诊断胰腺癌的效果，本专利技术人以标准操作程序（sop）采集符合标准的血液样本，建立完整的人群基础信息和临床资料，并采用了rt-pcr方法、taqman mirna array、real-time pcr（taqman探针）方法的多种进行实验验证。
12、具体的实验验证方法包括以下几个部分：
13、第一部分、研究对象选择和分组依据
14、a组：对照组（n=120，90例健康对照者，30例非胰腺肿瘤患者），无其他全身性重大疾病；
15、b组：胰腺癌患者（n=150），无其他全身性重大疾病。
16、第二部分、制备待测血清样本
17、（1）抽取被检测人员的外周血（2ml）放入分离胶采血管中，将分离胶采血管180°上下颠倒混匀，12小时内，将分离胶采血管在3,000×g条件下离心10分钟，然后将上清液转移到干净的管中得到待检测外周血血清，在-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.胰腺癌相关血清microRNA标志物，其特征在于，所述标志物由hsa-miR-125、hsa-miR-155、hsa-miR-21、hsa-miR-31、hsa-miR-3683和hsa-miR-4764构成；其中：hsa-miR-125的序列为tccctgagaccctttaacctgtga，hsa-miR-155的序列为ttaatgctaatcgtgataggggtt，hsa-miR-21的序列为tagcttatcagactgatgttga，hsa-miR-31的序列为aggcaagatgctggcata，hsa-miR-3683的序列为tgcgacattggaagtagtatca，hsa-miR-4764的序列为tggatgtggaaggagttatct。
2.一种胰腺癌诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种胰腺癌诊断方法，其特征在于，所述PCR检测试剂中含有的引物具体如下：标志物hsa-miR-125（SEQ ID No.1）的上游引物hsa-miR-125-F的序列为tccctgagaccctttaacctg（SE
...【技术特征摘要】
1.胰腺癌相关血清microrna标志物，其特征在于，所述标志物由hsa-mir-125、hsa-mir-155、hsa-mir-21、hsa-mir-31、hsa-mir-3683和hsa-mir-4764构成；其中：hsa-mir-125的序列为tccctgagaccctttaacctgtga，hsa-mir-155的序列为ttaatgctaatcgtgataggggtt，hsa-mir-21的序列为tagcttatcagactgatgttga，hsa-mir-31的序列为aggcaagatgctggcata，hsa-mir-3683的序列为tgcgacattggaagtagtatca，hsa-mir-4764的序列为tggatgtggaaggagttatct。
2.一种胰腺癌诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的一种胰腺癌诊断方法，其特征在于，所述pcr检测试剂中含有的引物具体如下：标志物hsa-mir-125（seq id no.1）的上游引物hsa-mir-125-f的序列为tccctgagaccctttaacctg（seq id no.7）；标志物hsa-mir-155（seq ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张炳强，陈梦梦，林泉，栾延松，于俊梅，周阳，孙国龙，江鑫，韩丽辉，孙允东，
申请(专利权)人：青岛瑞思德医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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