【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术属于生物医学，具体涉及一种抗人肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备方法。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、肝型脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid binding protein，l-fabp)，又称脂肪酸结合蛋白1，是脂肪酸结合蛋白家族的重要成员，主要在肝脏、小肠及肾脏等组织中表达。它是一种低分子量的胞浆蛋白，在哺乳动物中广泛存在，包括小肠、心、脑、骨骼肌等多种细胞内。l-fabp的主要功能是调节脂肪酸的摄取和胞内运输，能够将脂肪酸从细胞膜上运送到细胞内部，参与脂肪酸、胆固醇、胆汁酸等的转运过程。
2、l-fabp不仅在脂质代谢中起到转运作用，还与多种疾病的发生发展密切相关，如脂肪肝、肝硬化、肝癌、糖尿病等。近年来的研究发现，l-fabp不仅在肝脏疾病中有重要作用，还在肾脏疾病、肥胖、糖尿病肾病等多种疾病中发挥着关键作用，特别是在急性肾损伤(aki)的早期检测中，l-fabp作为一种新发现的生物标志物，可用于诊断和预测aki的严重程度和病因。
3、目前，检测人尿液或血清中l-fabp都采用免疫法，主要方法是酶联免疫法(elisa)和免疫分散比浊法，也有采用胶体金试纸条[赵俊平,刘红剑,何晓红,等.一种快速定量检测l-fabp的胶体金试纸,cn2014201176158,2014-03-14]和免疫荧光试纸条[赵俊平,刘红剑,何晓红,等.快速定量检测l-fabp的免疫荧光试纸条及其制备方法,cn2014101417159,2014-04-10]等方法，这些方法都需要
4、目前能提供l-fabp单克隆抗体的公司不多，且存在价格高，纯度不佳和特异性不足等问题。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种抗人l-fabp单克隆抗体的制备方法，本专利技术用重组大肠杆菌表达的人l-fabp作为抗原，通过杂交瘤技术制备得到高亲和力的l-fabp单克隆抗体，该抗体具有纯度高、特异性好的特点，可以用于免疫法检测人尿液以及血清中l-fabp含量，为l-fabp单克隆抗体的生产提供新方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供一种抗人l-fabp单克隆抗体的制备方法，所述方法为：以重组大肠杆菌表达的重组人l-fabp作为抗原，免疫balb/c小鼠后，取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过筛选，获得能稳定分泌l-fabp抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通过辛酸-硫酸铵沉淀法和protein a亲和柱层析法两步纯化获得高纯度l-fabp单克隆抗体。
4、进一步，重组人l-fabp氨基酸序列如seq id no:1所示。
5、进一步，所述的能分泌l-fabp单克隆抗体的杂交瘤细胞株按如下步骤获得：
6、(1)l-fabp免疫balb/c小鼠：初次免疫时，pbs缓冲液配制、浓度为1mg/ml的重组人l-fabp溶液与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化，经皮下多点注射6–8周龄雌性balb/c小鼠，免疫原用量为50–100μg/只，相同剂量每间隔2周注射一次，连续接种3次；最后一次注射2周后，用30–50μl相同浓度的重组人l-fabp溶液，直接注射小鼠脾脏加强免疫一次，获得l-fabp免疫小鼠；
7、(2)饲养层细胞的制备：处死正常6–8周龄雌性balb/c小鼠，75％酒精浸润消毒5–10min，用消毒后的剪刀在小鼠后腹部剪个小口，撕开其腹外皮肤，暴露腹膜；用无菌注射器取3–5ml预热至37℃的无血清imdm培养基注射小鼠腹腔，手指轻轻挤压腹部2–3次，悬浮腹腔细胞，用注射器回收腹腔液；从小鼠胸骨后轻轻地摘取胸腺，将其用无血清imdm培养基冲洗数次后，用一个无菌注射器柱塞橡胶头挤压研磨，收集液体，并与腹腔液混合，以1000–1500r/min离心5min后，弃上清，用15％(v/v)胎牛血清imdm培养基重悬，细胞浓度1×105–2×105个/ml，作为饲养层细胞；
8、(3)免疫脾细胞的制备：处死经步骤(1)免疫后的小鼠，用75％酒精浸润消毒5–10min，用消毒后的剪刀剪开小鼠腹部，用镊子和剪刀将脾脏剥离出来，除去脂肪和结缔组织，先用75％酒精洗涤，再用无血清imdm培养基淋洗后，置于筛网上，用无菌注射器的橡胶头充分研磨，用无血清imdm培养基将脾脏细胞冲洗进入无菌离心管，1000–1500r/min离心5min，弃上清，最后用无血清imdm培养基重悬，并进行计数，调整细胞浓度至1×108–2×108个/ml，作为免疫脾细胞；
9、(4)细胞融合：将骨髓瘤细胞sp2/0(pbs缓冲液悬浮，1×107–2×107个/ml)与步骤(3)制备的免疫脾细胞按体积比1:6–1:8的比例充分混匀，1000–1500r/min离心5min，弃上清，离心管倒置并轻轻敲击底部，尽量除去残留液，离心管置于37℃水浴中，1–2min内缓慢加入已预热37℃的1ml聚乙二醇-1500(peg-1500)，边加边摇晃，加完后及时用已预热37℃的20–30ml无血清imdm培养基终止融合作用，1000–1500r/min离心5min，弃上清，将沉淀的细胞用hat完全培养基(购自sigma公司)充分悬浮；96孔细胞培养板中，每孔加入100μl融合细胞悬液和100μl步骤(2)制备的饲养层细胞(1×105–2×105个/ml)，置于细胞培养箱(37℃、5％co2)培养；
10、(5)阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆：用0.05mol/l、ph 9.2–9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液将步骤(1)所用的重组人l-fabp溶液稀释成1–2μg/ml，50μl/孔加入96孔酶标板，4℃包被过夜后拍干，每孔加入pbs缓冲液配制浓度0.1g/l的牛血清白蛋白(bsa)200μl，4℃封闭过夜后拍干备用；取步骤(4)融合培养后的细胞培养上清50μl/孔加入酶标板，于37℃孵育60min后，0.01mol/l pbst缓冲液(含0.05％体积分数的tween-20的pbs缓冲溶液)洗涤并拍干，加入50μl/孔的二抗溶液(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg)，于37℃孵育30–40min后洗涤并拍干，加入50μl/孔tmb(四甲基联苯胺)显色液放置于37℃避光显色5min，加入50μl/孔的2mol/l h2so4水溶液终止反应；测定酶标板各孔的od450值，选择od450值最高的孔，采用有限稀释法将孔中的细胞进行克隆化，经过两次亚克隆后，获得稳定分泌l-fabp单克隆抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抗人肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为：以重组大肠杆菌表达的重组人肝型脂肪酸结合蛋白L-FABP作为抗原，免疫Balb/c小鼠后，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过筛选，获得能稳定分泌L-FABP抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通过辛酸-硫酸铵沉淀法和ProteinA亲和柱层析法两步纯化获得高纯度L-FABP单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组人肝型脂肪酸结合蛋白L-FABP氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的能分泌L-FABP单克隆抗体的杂交瘤细胞株按如下步骤获得：
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的利用杂交瘤细胞制备L-FABP单克隆抗体按如下步骤操作：
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)透析袋的截留分子量均为15kDa。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)超滤管截留分子量15kDa。
【技术特征摘要】
1.一种抗人肝型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法为：以重组大肠杆菌表达的重组人肝型脂肪酸结合蛋白l-fabp作为抗原，免疫balb/c小鼠后，取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经过筛选，获得能稳定分泌l-fabp抗体的杂交瘤细胞株；将杂交瘤细胞注射至小鼠腹腔，收集腹水后，通过辛酸-硫酸铵沉淀法和proteina亲和柱层析法两步纯化获得高纯度l-fabp单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，重组人肝型脂肪酸结合蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：王洋，袁春霖，徐欣，陈婷，崔文荣，陈建澍，梅建凤，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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