【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及仪器分析，特别涉及一种成像流式细胞术和空间编码试剂的高通量并行检测方法。
技术介绍
1、在液体活检等生物医学检测中需要对悬浮状态下不同的生物微粒或生物标记物进行高通量并行检测，以提高检测的速度和检测结果的准确性。常见的检测物包括核酸、蛋白和单细胞，常用的检测手段包括流式细胞仪和荧光显微镜。流式细胞仪能够实现对生物微粒的高通量检测，检测通量范围达到103-105微粒每秒，可以检测生物微粒的散射光和荧光信号，但该方法不具备二维的空间分辨力或成像能力。此外，流式细胞仪的检测数量受制于其对光谱的解析能力，即使采用最先进的光谱流式细胞仪或荧光强度编码的微球，其并行检测能力仍无法达到50个以上。荧光显微镜能够为生物微粒成像，通常通过下一代测序技术(next generation sequencing，ngs)对游离的核酸片段进行测序，通过酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)的方法分析游离蛋白，通过荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，fish)的方法对单细胞内的核酸进行分析，通过荧光标记的方法分析单细胞的蛋白。荧光显微镜结合空间编码试剂能够实现对102-103个不同待测物的并行检测。但荧光显微镜需要将待测物固定在基片上且单次成像视场内的待测物数量有限，因而操作复杂且检测通量远远低于流式细胞仪。综上得出，如果一种生物微粒检测方法能够实现102-105个不同待测物的并行检测，检测通量达到102-105个检测物每秒，同时适用
2、成像流式细胞仪是近年来新发展的生物微粒分析技术，通过将流式技术和高速显微技术相结合，实现了对高速流动状态下的生物微粒的多通道荧光和散射光成像，具备传统流式的高通量特性和显微成像的二维空间分辨能力。但现有成像流式细胞仪的并行检测数量依然受制于各个荧光试剂的光谱宽度，其并行检测的能力与传统流式细胞仪相同，依然无法实现50个以上的不同检测物的并行检测。在下一代测序技术中，荧光空间编码试剂被广泛采用，其通过对荧光团的空间编码可以实现102-103个不同的编码，并借助高分辨率显微镜成像对不同的空间编码进行识别。每个编码可以单独分配给一个待测物，因而具有极高的并行检测能力。但用于下一代测序技术的空间编码微球的尺寸极小，单个微球的尺寸多为10-100nm量级，因而无法被成像流式有效分辨，也未被用于成像流式检测。鉴于上述分析可知，目前亟需设计一种能够被成像流式细胞仪有效分辨的空间编码试剂，将成像流式细胞仪的高通量特点和空间编码试剂的高编码容量特点相结合，进而实现一种能够对多种生物微粒进行高通量并行检测的方法。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提供一种基于成像流式细胞术和空间编码试剂的高通量并行检测方法，该方法将成像流式细胞仪的高通量特点和空间编码试剂的高编码容量特点相结合，可实现核酸测序、蛋白检测和单细胞分析的高通量并行检测，可用于液体活检或其他需要对不同生物标记物进行高通量同步检测的生物医学应用需求。
2、为此，本专利技术第一方面提供一种生物微粒高通量并行检测的方法，所述方法包括：
3、(1)选取荧光光谱重合度小的荧光标记物，将所述荧光标记物标记在微球表面，将经标记的微球在空间上排列组合后相连接构成空间编码试剂，所述空间编码试剂排列构成编码序列库；
4、(2)利用已知的生物微粒构建生物微粒库，并对所述生物微粒库库中每一个生物微粒分配一个所述编码序列库中的唯一的空间编码试剂，建立所述编码序列库与所述生物微粒库的一一对应关系；
5、(3)利用空间编码试剂对待测生物微粒进行标记，组成待测物；
6、(4)将悬浮状态下的所述待测物置于成像流式细胞仪流道中进行检测，获取待测生物微粒信息。
7、本专利技术提供的生物微粒高通量并行检测方法基于成像流式细胞术和空间编码试剂。其中所述空间编码试剂可由不同颜色的荧光微球在空间上排列组合而成，根据荧光微球颜色的种类和荧光微球的空间位置，空间编码试剂可以形成不同的编码序列，进行形成编码序列库。例如，如果有4种不同颜色的荧光微球，且一个空间编码试剂2由4个微球组成，则可形成44，即256种不同的编码序列；如果有5种不同颜色的荧光微球，且一个空间编码试剂由4个微球组成，则可形54，即625种不同的编码序列；如果有5种不同颜色的荧光微球，且一个空间编码试剂由5个微球组成，则可形成55，即3125种不同的编码序列；如果有10种不同颜色的荧光微球，且一个空间编码试剂由4或5个微球组成，则可形成104或105种不同的编码序列。相对于尺寸极小的空间编码微球而言，本专利技术提供的空间编码试剂具有高编码容量，可用于成像流式细胞仪中实现对多种生物微粒进行高通量并行检测。
8、根据本专利技术的实施例，步骤(2)中所述生物微粒包括核酸、蛋白、细菌、病毒、外泌体和单细胞中的至少一种。
9、根据本专利技术的实施例，所述微球包括选自聚苯乙烯微球、聚乙烯微球、硅球、二氧化硅微球、磁性微球、交联聚苯乙烯/聚二乙烯苯微球和聚甲基丙烯酸酯微球的至少一种。
10、根据本专利技术的实施例，步骤(3)中所述空间编码试剂的微球颜色种类和空间位置排列与所述待测生物微粒相对应的所述编码序列库中的空间编码试剂的微球颜色种类和空间位置排列一致。
11、根据本专利技术的实施例，步骤(4)中所述成像流式细胞仪流道中液流的中心流动速度为0.1-20m/s。
12、根据本专利技术的实施例，步骤(4)中所述待测生物微粒信息通过获得与待测生物微粒相连的空间编码试剂的微球颜色种类和空间位置，利用所述编码序列库与所述生物微粒库的对应关系得到。
13、本专利技术第二方面提供一种高通量测序的方法，所述方法包括：
14、(1)选取荧光光谱重合度小的荧光标记物，将所述荧光标记物标记在微球表面，将经标记的微球在空间上排列组合后相连接构成空间编码试剂，所述空间编码试剂排列构成编码序列库；其中所述空间编码试剂的一端与核酸单链a连接，所述核酸单链a中未与所述空间编码试剂相连的一端含有与待测单链核酸中一部分碱基互补配对的碱基；
15、(2)将荧光团和核酸单链b相连制备报告探针，其中核酸单链b中未与所述荧光团相连的一端含有与所述待测单链核酸中一部分碱基互补配对的碱基，且在所述待测单链核酸中，与所述核酸单链a互补配对的部分和与所述核酸单链b互补配对的部分无重叠；
16、(3)将待测单链核酸片段构建成核酸序列库，并对所述核酸序列库中每一个核酸片段分配一个所述编码序列库中的唯一的空间编码试剂；
17、(4)将空间编码试剂和所述报告探针同时与待测单链核酸序列进行结合，组成待测物，其中，所述空间编码试剂为所述核酸序列库中所有核酸序列种类相对应的空间编码本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生物微粒高通量并行检测的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述生物微粒包括核酸、蛋白、细菌、病毒、外泌体和单细胞中的至少一种；
3.一种高通量测序的方法，其特征在于，包括：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述成像流式细胞仪流道中液流的中心流动速度为0.1-20m/s；
5.一种高通量检测蛋白的方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述成像流式细胞仪流道中液流的中心流动速度为0.1-20m/s；
7.一种单细胞检测的方法，其特征在于，包括：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述成像流式细胞仪流道中液流的中心流动速度为0.1-20m/s；
9.一种用于对液体活检样品进行高通量并行检测的方法，其特征在于，包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述液体活检样品中含有cfDNA、细胞、游离的RNA、DNA、外泌体、游离的蛋白中的至少一种；
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