【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
1、葡萄膜黑色素瘤(um)是一种罕见的恶性肿瘤，占所有黑色素瘤的3％-5％，发病率为每100万人6-10例，美国每年新增病例2500-3000例。尽管局部疾病控制率很高(5年osr70％)，但高达50％的患者将出现转移性疾病(肝60％，肺25％；中位os13个月，2年osr8％)。对于确实发生转移性疾病的患者，尚无经过验证的护理标准。为了改善转移性um患者的预后，医学上迫切需要专门批准的治疗和专门的疾病管理策略。
2、gnaq或gna11的致癌突变是葡萄膜黑色素瘤的标志性突变。gnaq/11水平的降低会导致细胞增殖抑制和凋亡。抑制作用可以通过靶向递送抑制gnaq/11活性的抗体药物缀合物来实现。尽管最近取得了进展，但仍然需要开发用于抗体药物缀合物的新颖生物材料、制造方法和配制品。
技术实现思路
1、本披露至少部分提供了以高滴度和/或分离产率产生酯肽(例如化合物(a1))的基因工程改造的微生物(例如，痘苗色杆菌(chromobacterium vaccinii))。在一些实施例中，微生物包括与酯肽的生物合成基因簇(bgc)可操作地连接的非原初启动子。在一些实施例中，干扰酯肽分离的天然产物的bgc被破坏。还描述了使用本文所述的微生物产生酯肽例如化合物(a1)的方法。通过本文描述的方法产生的酯肽，例如化合物(a1)，可用于例如根据本文描述的方法产生抗体药物缀合物(例如本文描述的抗体药物缀合物)。
2、本披露还至少部分地提供了用于生产部分再氧化的抗体或其
3、本披露还至少部分地提供了抗体药物缀合物(例如，本文所述的抗体药物缀合物)的配制品。在一些实施例中，配制品包含本文所述的抗体药物缀合物、缓冲剂、稳定剂和表面活性剂，并且具有约4.5至约6.5的ph。在一些实施例中，配制品是冻干配制品。本文描述的配制品可用于治疗或预防障碍，例如癌症。在一些实施例中，癌症表达pmel17和/或含有gnaq或gna11基因中的突变。在一些实施例中，癌症是癌(例如肝细胞癌)、肉瘤、白血病、淋巴瘤、眼癌、眼部肿瘤、黑色素瘤(例如葡萄膜黑色素瘤、非葡萄膜黑色素瘤、恶性黑色素瘤、眼部黑色素瘤、皮下黑色素瘤、皮肤黑色素瘤或粘膜黑色素瘤)或其转移性癌症。工程改造的微生物和生产化合物的方法
4、一方面，本披露的特征在于一种微生物，其包含核酸，该核酸包含编码与具有式(a1)结构的化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列，其中该核苷酸序列可操作地连接至非原初启动子。
5、在一些实施例中，微生物是天然产生化合物的微生物的基因工程改造形式。在一些实施例中，微生物是细菌。在一些实施例中，微生物是色杆菌属。在一些实施例中，微生物是痘苗色杆菌。在一些实施例中，微生物是痘苗色杆菌dsm 25150(＝atcc baa-2314、＝nrrl b-50840、＝mwu205)。在一些实施例中，微生物是分离的微生物。在一些实施例中，微生物是合成的微生物。
6、在一些实施例中，核酸位于微生物的染色体上，例如天然位于染色体上或稳定整合至染色体。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于生物合成基因簇(bgc)中。在一些实施例中，bgc是化合物(a1)-bgc。在一些实施例中，化合物(a1)-bgc具有图1中所示的基因组织。
7、在一些实施例中，bgc包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部)或其同系物。在一些实施例中，bgc包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物。
8、在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh或其同系物中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa或其同系物的区域中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa和frsb或其同系物的区域中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa、frsb和frsc或其同系物的区域中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc和frsd或其同系物的区域中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd和frse或其同系物的区域中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse和frsf或其同系物的区域中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf和frsg或其同系物的区域中。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物的区域中。
9、在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa和frsb或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa、frsb和frsc或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc和frsd或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd和frse或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse和frsf或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf和frsg或其同系物的编码序列。在一些实施例中，编码与化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种微生物，其包含核酸，所述核酸包含编码与具有式(A1)结构的化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接至非原初启动子。
2.如权利要求1所述的微生物，其是天然产生所述化合物的微生物的基因工程改造形式。
3.如权利要求1或2中任一项所述的微生物，其是细菌，例如色杆菌属。
4.如权利要求1-3中任一项所述的微生物，其是痘苗色杆菌，例如痘苗色杆菌DSM25150(＝ATCC BAA-2314、＝NRRL B-50840、＝MWU205)。
5.如权利要求1-4任一项所述的微生物，其是分离的微生物或合成的微生物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的微生物，其中所述核酸位于所述微生物的染色体上，例如天然位于所述染色体上或稳定整合至所述染色体。
7.如权利要求1-6中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于生物合成基因簇(BGC)中。
8.如权利要求1-7中任一项所述的微生物，其中所述BGC是化合物(A1)-BGC，例如，如图1所示。
<...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种微生物，其包含核酸，所述核酸包含编码与具有式(a1)结构的化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接至非原初启动子。
2.如权利要求1所述的微生物，其是天然产生所述化合物的微生物的基因工程改造形式。
3.如权利要求1或2中任一项所述的微生物，其是细菌，例如色杆菌属。
4.如权利要求1-3中任一项所述的微生物，其是痘苗色杆菌，例如痘苗色杆菌dsm25150(＝atcc baa-2314、＝nrrl b-50840、＝mwu205)。
5.如权利要求1-4任一项所述的微生物，其是分离的微生物或合成的微生物。
6.如权利要求1-5中任一项所述的微生物，其中所述核酸位于所述微生物的染色体上，例如天然位于所述染色体上或稳定整合至所述染色体。
7.如权利要求1-6中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于生物合成基因簇(bgc)中。
8.如权利要求1-7中任一项所述的微生物，其中所述bgc是化合物(a1)-bgc，例如，如图1所示。
9.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中所述bgc包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部)或其同系物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的微生物，其中所述bgc包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物。
11.如权利要求1-10中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh或其同系物中。
12.如权利要求1-11中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa或其同系物的区域中。
13.如权利要求1-12中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa和frsb或其同系物的区域中。
14.如权利要求1-13中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb和frsc或其同系物的区域中。
15.如权利要求1-14中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc和frsd或其同系物的区域中。
16.如权利要求1-15中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd和frse或其同系物的区域中。
17.如权利要求1-16中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse和frsf或其同系物的区域中。
18.如权利要求1-17中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf和frsg或其同系物的区域中。
19.如权利要求1-18中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物的区域中。
20.如权利要求1-19中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg、frsh或其同系物的编码序列。
21.如权利要求1-20中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa或其同系物的编码序列。
22.如权利要求1-21中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa和frsb或其同系物的编码序列。
23.如权利要求1-22中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb和frsc或其同系物的编码序列。
24.如权利要求1-23中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc和frsd或其同系物的编码序列。
25.如权利要求1-24中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd和frse或其同系物的编码序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse和frsf或其同系物的编码序列。
27.如权利要求1-26中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf和frsg或其同系物的编码序列。
28.如权利要求1-27中任一项所述的微生物，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物的编码序列。
29.如权利要求1-28中任一项所述的微生物，其中所述核酸包含使用seq id no:317的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:317的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列产生自同源重组事件(例如，用于启动子交换)的核苷酸序列。
30.如权利要求1-29中任一项所述的微生物，其中所述核酸包含与genbank登录号：bankit2437961 bseq#1 mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段，或与bankit2437961bseq#1 mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
31.如权利要求1-30中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子来自相同的微生物。
32.如权利要求1-30中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子来自不同的微生物。
33.如权利要求1-32中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含viop启动子、nptii启动子、rbs启动子、j23119启动子、plpp启动子、ps12burk启动子、pem7或erme*启动子，任选地，其中所述非原初启动子包含viop启动子、nptii启动子或rbs启动子。
34.如权利要求1-33中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq id no:264-266、268-271或316中任一个的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:264-266、268-271或316中任一个的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
35.如权利要求1-34中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:264-266、268-271或316中任一个的核苷酸序列或其功能片段。
36.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含viop启动子。
37.如权利要求1-36中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq id no:264的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:264的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
38.如权利要求1-37中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:264的核苷酸序列或其功能片段。
39.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含nptii启动子。
40.如权利要求1-35或39中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq idno:265的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:265的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
41.如权利要求1-35、39或40中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:265的核苷酸序列或其功能片段。
42.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含rbs启动子。
43.如权利要求1-35或42中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq idno:266的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:266的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
44.如权利要求1-35、42或43中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:266的核苷酸序列或其功能片段。
45.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含j23119启动子。
46.如权利要求1-35或45中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq idno:316的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:316的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
47.如权利要求1-35、45或46中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:316的核苷酸序列或其功能片段。
48.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含plpp启动子。
49.如权利要求1-35或48中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq idno:268的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:268的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
50.如权利要求1-35、48或49中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:268的核苷酸序列或其功能片段。
51.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含pem7启动子。
52.如权利要求1-35或51中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq idno:269的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:269的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
53.如权利要求1-35、51或52中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:269的核苷酸序列或其功能片段。
54.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含ps12burk启动子。
55.如权利要求1-35或54中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq idno:270的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:270的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
56.如权利要求1-35、54或55中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:270的核苷酸序列或其功能片段。
57.如权利要求1-35中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含erme*启动子。
58.如权利要求1-35或57中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含seq idno:271的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:271的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
59.如权利要求1-35、57或58中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:271的核苷酸序列或其功能片段。
60.如权利要求1-59中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子控制frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部)或其同系物的转录。
61.如权利要求1-60中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子控制frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物的转录。
62.如权利要求1-61中任一项所述的微生物，其中所述非原初启动子插入frsa或其同系物的编码区上游，例如frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh中全部或其同系物的编码区上游。
63.如权利要求1-62中任一项所述的微生物，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是非核糖体肽合成酶(nrps)或其功能片段。
64.如权利要求1-63中任一项所述的微生物，其中所述nrps是frsa、frsd、frse、frsf或frsg，或其同系物。
65.如权利要求1-64中任一项所述的微生物，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是mbth样蛋白或其功能片段。
66.如权利要求1-65中任一项所述的微生物，其中所述mbth样蛋白是frsb或其同系物。
67.如权利要求1-66中任一项所述的微生物，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是苹果酸脱氢酶。
68.如权利要求1-67中任一项所述的微生物，其中所述苹果酸脱氢酶是frsc或其同系物。
69.如权利要求1-68中任一项所述的微生物，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是羟化酶。
70.如权利要求1-69中任一项所述的微生物，其中所述羟化酶是frsh或其同系物。
71.如权利要求1-70中任一项所述的微生物，其中所述核酸包含编码与所述化合物的生产相关的多个多肽的多个核苷酸序列。
72.如权利要求1-71中任一项所述的微生物，其中与所述化合物的生产相关的所述多个多肽包含多个nrps或其功能片段。
73.如权利要求1-72中任一项所述的微生物，其中所述多个nrps包含frsa、frsd、frse、frsf或frsg中的两个或更多个(例如，三个、四个或全部)或其同系物。
74.如权利要求1-73中任一项所述的微生物，其中与所述化合物的生产相关的所述多个多肽包含nrps、mbth样蛋白、苹果酸脱氢酶和羟化酶或其功能片段。
75.如权利要求1-74中任一项所述的微生物，其中与所述化合物的生产相关的所述多个多肽包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物。
76.如权利要求1-75中任一项所述的微生物，其中所述微生物具有所述化合物的增加的滴度。
77.如权利要求1-76中任一项所述的微生物，其中当在允许生产所述化合物的条件下培养时，与参考微生物相比，所述化合物的滴度增加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，所述参考微生物是例如，在所述化合物(a1)-bgc中不包含所述非原初启动子的但在其他方面相同的微生物(例如，野生型)。
78.如权利要求1-77中任一项所述的微生物，其中当在允许生产所述化合物的条件下培养时，与参考微生物相比，所述化合物的滴度增加至少约100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l、700mg/l、800mg/l、900mg/l或1000mg/l，所述参考微生物是例如，在所述化合物(a1)-bgc中不包含所述非原初启动子的但在其他方面相同的微生物(例如，野生型)。
79.如权利要求1-78中任一项所述的微生物，其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc被改变，例如，被破坏。
80.如权利要求1-79中任一项所述的微生物，其中所述天然产物包含以下中的一种或多种(例如，两种、三种或全部)：紫色杆菌素、化合物j、化合物f5、化合物f3或化合物d。
81.如权利要求1-80中任一项所述的微生物，其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc的至少一部分被缺失。
82.如权利要求1-81中任一项所述的微生物，其中所述紫色杆菌素-bgc被改变，例如，被破坏。
83.如权利要求1-82中任一项所述的微生物，其中所述化合物j-bgc被改变，例如，被破坏。
84.如权利要求1-83中任一项所述的微生物，其中所述化合物j-bgc与化合物j、化合物f5、化合物f3和化合物d的生产相关。
85.如权利要求1-84中任一项所述的微生物，其中所述紫色杆菌素-bgc和所述化合物j-bgc都被改变，例如，被破坏。
86.如权利要求1-85中任一项所述的微生物，其中所述天然产物的产量被降低例如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
87.如权利要求1-86中任一项所述的微生物，其中所述微生物具有所述化合物的增加的分离产率。
88.如权利要求1-87中任一项所述的微生物，其中与参考微生物相比，所述化合物的分离产率增加了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，所述参考微生物是例如其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc没有被改变的但在其他方面相同的微生物(例如野生型)。
89.如权利要求1-88中任一项所述的微生物，其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc没有被改变，例如，没有被破坏。
90.一种生产具有式(a1)结构的化合物的微生物，其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc被改变。
91.如权利要求90所述的微生物，其中所述天然产物包含以下中的一种或多种(例如，两种、三种或全部)：紫色杆菌素、化合物j、化合物f5、化合物f3或化合物d。
92.如权利要求90或91中任一项所述的微生物，其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc的至少一部分被缺失。
93.如权利要求90-92中任一项所述的微生物，其中所述紫色杆菌素-bgc被改变，例如，被破坏。
94.如权利要求90-93中任一项所述的微生物，其中所述化合物j-bgc被改变，例如，被破坏。
95.如权利要求90-94中任一项所述的微生物，其中所述化合物j-bgc与化合物j、化合物f5、化合物f3和化合物d的生产相关。
96.如权利要求90-95中任一项所述的微生物，其中所述紫色杆菌素-bgc和所述化合物j-bgc都被改变，例如，被破坏。
97.如权利要求90-96中任一项所述的微生物，其中所述天然产物的产量被降低例如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
98.如权利要求90-97中任一项所述的微生物，其中所述微生物具有所述化合物的增加的分离产率。
99.如权利要求90-98中任一项所述的微生物，其中与参考微生物相比，所述化合物的分离产率增加了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，所述参考微生物是例如其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc没有被改变的但在其他方面相同的微生物(例如野生型)。
100.一种生产具有式(a1)结构的化合物的方法，所述方法包括：
101.如权利要求100所述的方法，其中所述微生物以50l至500l规模，例如，50l、100l、150l、200l、250l、300l、350l、400l、450l或500l规模培养(例如，发酵)。
102.如权利要求100所述的方法，其中所述微生物以1,000l至20,000l规模，例如，1,000l至10,000l或10,000l至20,000l，例如1,000l、2,000l、5,000l、7,500l、10,000l、15,000l或20,000l规模培养(发酵)。
103.如权利要求100-102中任一项所述的方法，其中所述培养(例如，发酵)产生滴度为至少200ml的所述化合物，例如，至少250mg/ml、300mg/l、400mg/l、500mg/l、600mg/l、700mg/l、800mg/l、900mg/l、1000mg/l、1100mg/l、1200mg/l、1300mg/l、1400mg/l、1500mg/l、1600mg/l、1700mg/l、1800mg/l、1900mg/l或2000mg/l的所述化合物。
104.如权利要求100-103中任一项所述的方法，所述方法进一步包括分离所述化合物，例如达到至少90％的纯度，例如至少95％、96％、97％、98％或99％的纯度，例如，如通过本文描述的方法确定。
105.一种核酸，其包含编码与具有式(a1)结构的化合物的生产相关的多肽的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作地连接至非原初启动子。
106.如权利要求105所述的核酸，其中所述核酸位于所述微生物的染色体上，例如天然位于所述染色体上或稳定整合至所述染色体。
107.如权利要求105或106中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于生物合成基因簇(bgc)中。
108.如权利要求105-107中任一项所述的核酸，其中所述bgc是化合物(al)-bgc。
109.如权利要求105-108中任一项所述的核酸，其中所述化合物(a1)-bgc具有图1中所示的基因组织。
110.如权利要求105-109中任一项所述的核酸，其中所述bgc包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部)或其同系物。
111.如权利要求105-110中任一项所述的核酸，其中所述bgc包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物。
112.如权利要求105-111中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg、frsh或其同系物中。
113.如权利要求105-112中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa或其同系物的区域中。
114.如权利要求105-113中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa和frsb或其同系物的区域中。
115.如权利要求105-114中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb和frsc或其同系物的区域中。
116.如权利要求105-115中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc和frsd或其同系物的区域中。
117.如权利要求105-116中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd和frse或其同系物的区域中。
118.如权利要求105-117中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse和frsf或其同系物的区域中。
119.如权利要求105-118中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf和frsg或其同系物的区域中。
120.如权利要求105-119中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列位于包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物的区域中。
121.如权利要求105-120中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg、frsh或其同系物的编码序列。
122.如权利要求105-121中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa或其同系物的编码序列。
123.如权利要求105-122中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa和frsb或其同系物的编码序列。
124.如权利要求105-123中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb和frsc或其同系物的编码序列。
125.如权利要求105-124中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc和frsd或其同系物的编码序列。
126.如权利要求105-125中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd和frse或其同系物的编码序列。
127.如权利要求105-126中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse和frsf或其同系物的编码序列。
128.如权利要求105-127中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf和frsg或其同系物的编码序列。
129.如权利要求105-128中任一项所述的核酸，其中编码与所述化合物的生产相关的多肽的所述核苷酸序列包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物的编码序列。
130.如权利要求105-129中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含使用seq id no:317的核苷酸序列或其功能片段、或与seq id no:317的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列产生自同源重组事件(例如，用于启动子交换)的核苷酸序列。
131.如权利要求105-130中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含与genbank登录号：bankit2437961bseq#1mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段，或与bankit2437961bseq#1mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
132.如权利要求105-131中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含viop启动子、nptii启动子、rbs启动子、j23119启动子、plpp启动子、ps12burk启动子、pem7或erme*启动子，任选地，其中所述非原初启动子包含viop启动子、nptii启动子或rbs启动子。
133.如权利要求105-132中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seq idno:264-266、268-271或316中任一个的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:264-266、268-271或316中任一个的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
134.如权利要求105-133中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:264-266、268-271或316中任一个的核苷酸序列或其功能片段。
135.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含viop启动子。
136.如权利要求105-135中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seq idno:264的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:264的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
137.如权利要求105-136中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:264的核苷酸序列或其功能片段。
138.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含nptii启动子。
139.如权利要求105-134或138中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seqid no:265的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:265的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
140.如权利要求105-134、138或139中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:265的核苷酸序列或其功能片段。
141.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含rbs启动子。
142.如权利要求105-134或141中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seqid no:266的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:266的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
143.如权利要求105-134、141或142中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:266的核苷酸序列或其功能片段。
144.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含j23119启动子。
145.如权利要求105-134或144中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seqid no:316的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:316的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
146.如权利要求105-134、144或145中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:316的核苷酸序列或其功能片段。
147.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含plpp启动子。
148.如权利要求105-134或147中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seqid no:268的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:268的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
149.如权利要求105-134、147或148中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:268的核苷酸序列或其功能片段。
150.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含pem7启动子。
151.如权利要求105-134或150中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seqid no:269的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:269的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
152.如权利要求105-134、150或151中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:269的核苷酸序列或其功能片段。
153.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含ps12burk启动子。
154.如权利要求105-134或153中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seqid no:270的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:270的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
155.如权利要求105-134、153或154中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:270的核苷酸序列或其功能片段。
156.如权利要求105-134中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含erme*启动子。
157.如权利要求105-134或156中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含seqid no:271的核苷酸序列或其功能片段，或与seq id no:271的核苷酸序列或其功能片段具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或差异不超过60、50、40、30、20、15、10、5或2个核苷酸的核苷酸序列。
158.如权利要求105-134、156或157中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子包含以下或由以下组成：seq id no:271的核苷酸序列或其功能片段。
159.如权利要求105-158中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子控制frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg或frsh中的一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部)或其同系物的转录。
160.如权利要求105-159中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子控制frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物的转录。
161.如权利要求105-160中任一项所述的核酸，其中所述非原初启动子插入frsa或其同系物的编码区上游，例如frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh中全部或其同系物的编码区上游。
162.如权利要求105-161中任一项所述的核酸，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是非核糖体肽合成酶(nrps)或其功能片段。
163.如权利要求105-162中任一项所述的核酸，其中所述nrps是frsa、frsd、frse、frsf或frsg，或其同系物。
164.如权利要求105-163中任一项所述的核酸，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是mbth样蛋白或其功能片段。
165.如权利要求105-164中任一项所述的核酸，其中所述mbth样蛋白是frsb或其同系物。
166.如权利要求105-165中任一项所述的核酸，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是苹果酸脱氢酶。
167.如权利要求105-166中任一项所述的核酸，其中所述苹果酸脱氢酶是frsc或其同系物。
168.如权利要求105-167中任一项所述的核酸，其中与所述化合物的生产相关的所述多肽是羟化酶。
169.如权利要求105-168中任一项所述的核酸，其中羟化酶是frsh或其同系物。
170.如权利要求105-169中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含编码与所述化合物的生产相关的多个多肽的多个核苷酸序列。
171.如权利要求105-170中任一项所述的核酸，其中与所述化合物的生产相关的所述多个多肽包含多个nrps或其功能片段。
172.如权利要求105-171中任一项所述的核酸，其中所述多个nrps包含frsa、frsd、frse、frsf或frsg中的两个或更多个(例如，三个、四个或全部)或其同系物。
173.如权利要求105-172中任一项所述的核酸，其中与所述化合物的生产相关的所述多个多肽包含nrps、mbth样蛋白、苹果酸脱氢酶和羟化酶或其功能片段。
174.如权利要求105-173中任一项所述的核酸，其中与所述化合物的生产相关的所述多个多肽包含frsa、frsb、frsc、frsd、frse、frsf、frsg和frsh或其同系物。
175.一种核酸，其包含编码与以下中一种或多种的生产相关的多肽的核苷酸序列：化合物j、化合物f5、化合物f3或化合物d。
176.如权利要求175所述的核酸，其是分离的核酸、非天然存在的核酸或合成的核酸。
177.如权利要求175或176中任一项所述的核酸，其包含突变，例如缺失。
178.如权利要求175-177中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含编码与以下中一种或多种的生产相关的多个多肽的多个核苷酸序列：化合物j、化合物f5、化合物f3或化合物d。
179.如权利要求175-178中任一项所述的核酸，其中所述核苷酸序列来自bgc。
180.如权利要求179所述的核酸，其中所述bgc是化合物j-bgc。
181.如权利要求180所述的核酸，其中所述化合物j-bgc具有图1中所示的基因组织。
182.如权利要求175-181中任一项所述的核酸，其中所述核苷酸序列包含dis1、dis2、dis3、或dis4中的一个或多个(例如，两个、三个或全部)，或其同系物。
183.如权利要求175-182中任一项所述的核酸，其中所述核苷酸序列包含dis1、dis2、dis3和dis4或其同系物。
184.如权利要求175-183中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含与genbank登录号：bankit2437961 bseq#1 mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段，或与bankit2437961bseq#1 mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
185.一种载体，其包含如权利要求105-184中任一项所述的核酸。
186.一种细胞，其包含如权利要求105-184中任一项所述的核酸或如权利要求185所述的载体。
187.一种对细胞进行工程改造的方法，所述方法包括：
188.如权利要求187所述的方法，其中所述细胞是天然生产具有式(a1)结构的化合物的微生物。
189.如权利要求187或188中任一项所述的方法，其中所述微生物是细菌，例如色杆菌属。
190.如权利要求187-189中任一项所述的方法，其中所述微生物是痘苗色杆菌，例如痘苗色杆菌dsm 25150(＝atcc baa-2314、＝nrrl b-50840、＝mwu205)。
191.如权利要求187-190中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列被破坏，例如，所述核苷酸序列的至少一部分被缺失。
192.如权利要求187-191中任一项所述的方法，其中所述核酸包含编码与以下中一种或多种的生产相关的多个多肽的多个核苷酸序列：化合物j、化合物f5、化合物f3或化合物d。
193.如权利要求187-192中任一项所述的方法，其中化合物j、化合物f5、化合物f3或化合物d中的一个或多个(例如，两个、三个或全部)的产量被降低例如至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
194.如权利要求187-193中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列来自bgc。
195.如权利要求194所述的方法，其中所述bgc是化合物j-bgc。
196.如权利要求195所述的方法，其中所述化合物j-bgc具有图1中所示的基因组织。
197.如权利要求187-196中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列包含dis1、dis2、dis3、或dis4中的一个或多个(例如，两个、三个或全部)，或其同系物。
198.如权利要求187-197中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列包含dis1、dis2、dis3和dis4或其同系物。
199.如权利要求187-198中任一项所述的方法，其中所述核酸包含与genbank登录号：bankit2437961 bseq#1 mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段，或与bankit2437961bseq#1 mw732719相关的核苷酸序列或其功能片段具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
200.如权利要求187-199中任一项所述的方法，其中所述改变增加了所述化合物的分离产率。
201.如权利要求187-200中任一项所述的方法，其中与参考微生物相比，所述化合物的分离产率增加了20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，所述参考微生物是例如其中干扰所述化合物分离的天然产物的bgc没有被改变的但在其他方面相同的微生物(例如野生型)。
202.一种用于生产部分再氧化的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
203.如权利要求202所述的方法，其中所述一个或多个加帽半胱氨酸残基位于所述抗体或其抗原结合片段的重链恒定结构域中。
204.如权利要求202或203中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含四个加帽半胱氨酸残基。
205.如权利要求202-204中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含两个加帽半胱氨酸残基。
206.如权利要求202-205中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含位于所述抗体或其抗原结合片段的ch1区中的加帽半胱...
【专利技术属性】
技术研发人员：AS·布鲁梅尔，K·邦汀，J·A·达莱西奥，范莉琼，B·费斯勒，D·加布里埃尔，D·海兹尔，K·霍夫马斯特，S·艾耶，E·科赫拉，E·曼查多罗伯斯，P·毛登斯，D·皮斯托里乌斯，R·拉莫特，V·罗曼内，K·乌尔施，P·叶拉米里拉奥，
申请(专利权)人：诺华股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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