【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体及构建方法与应用。
技术介绍
1、毕赤酵母由于其内部发生同源重组的概率极低，一般的基于同源重组的敲除方法在毕赤酵母中并不适用。现有的基于同源重组的敲除技术大多会用筛选标记基因替换掉需敲除的基因，而遗留的筛选标记对后续的实验设计会造成很大的影响，因此开发新的毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体则非正常的有必要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于开发新的毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体，从而提高毕赤酵母基因敲除的成功率，同时对敲除时使用的筛选标记进行回收。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
3、以ppiczαa为模板，引入cre/loxp体系，设计构建载体。通过不同的培养条件筛选出利用同源重组实现基因敲除与抗体回收的菌株。
4、技术路线如下：
5、载体设计——转化涂板(抗性筛选)——菌落鉴定(确认目的基因敲除效果)——诱导培养(抗性回收)——1*ypda板划线(分离单菌落)——抗性筛选(确认抗性基因回收效果)
6、具体的步骤如下：
7、步骤1、以ppiczαa为原始载体，设计合成敲除用质粒：
8、上游同源臂序列：ccgctaaaagacccggaaaaccgagagaactctggattagcagtctgaaaa agaatcttcactctgtctagtggagcaattaatgtcttagcggcacttcctgctac
9、下游同源臂序列：agattagagaatgaataccttcttctaagcgatcgtccgtcatcatagaat atcatggactgtatagttttttttttgtacatataatgattaaacggtcatccaacatctcgttgacagatctctcagtacgcgaaatccctgactatcaaagcaagaaccgatgaagaaaaaaacaacagtaacccaaacaccacaacaaacactttatcttctcccccccaacaccaatcatcaaagagatgtcggaaccaaacaccaagaagcaaaaactaaccccatataaaaacatcctggtagataatgctggtaacccgctctccttccatattctgggctacttcacgaagtctgaccggtctcagttgatcaacatgatcctcgaaatgggtggcaagatcgttccagacctgcctcctctggtagatggagtgttgtttttgacaggggattacaagtctattgatgaagataccctaaagcaactgggggacgttccaatatacagagactccttcatctaccagtgttttgtgcacaagacatctcttcccattgacactttccgaattgacaagaacgtcgacttggctcaagatttgatcaatagggcccttcaagagtctgtggatcatgtcacttctgccagcacagctgcagctgctgctgttgttgtcgctaccaacggcctgtcttctaaaccagacgctcgtactagcaaaatacagttcactcccgaagaagatcgttttattcttgactttgttaggagaaatcctaaacgaagaaacacacatcaactgtacactgagctcgctcagcacatgaaaaaccatacgaatcattctatccgccacagatttcgtcgtaatctttccgctcaacttgattgggtttatgatatcgatccattgaccaacca
10、acctcgaaaagatgaaaacgggaactacatcaaggtacaagatcttcc；
11、步骤2、用noti酶切质粒，转化gs115，涂1*ypda(+zeocin)板，30℃培养2d；
12、步骤3、菌落pcr：鉴定目的基因是否已被质粒序列替换。性状稳定的菌落进行下一步；
13、步骤4、挑取单菌落，甲醇浓度5％，1*bmmy，28℃培养48h；
14、步骤5、菌液在1*ypda板划线培养，区分单菌落。
15、步骤6、挑取单菌落，分别在1*ypda/1*ypda(+zeocin)平板上点菌培养：当出现仅在1*ypda板生长，在1*ypda(+zeocin)板完全不生长的菌落时，为抗性回收成功菌株。
16、本专利技术所达到的有益效果是：本专利技术开发出了新的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体的构建方法，其特征在于，
2.权利要求1所述方法构建的毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体。
3.权利要求2所述的载体在毕赤酵母基因敲除中的应用。
4.一种用于敲除毕赤酵母基因的成套产品，其包括权利要求2中所述的载体。
【技术特征摘要】
1.毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体的构建方法，其特征在于，
2.权利要求1所述方法构建的毕赤酵母基因敲除和抗性基因回收载体。
【专利技术属性】
技术研发人员：柳曹枝，陈彦羽，
申请(专利权)人：南京瑞源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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