【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种微环境循环细胞药物敏感性检测方法及试剂盒。
技术介绍
1、在临床治疗中，针对肿瘤患者的个体化药物治疗已成为提高疗效和降低毒副作用的重要手段。然而，肿瘤药物反应具有异质性，即同一种药物在不同部位、不同病程、不同病灶的患者身上可能产生不同的反应。这使得直接从患者体内获取组织样本进行药敏检测变得困难且成本较高。此外，手术、穿刺、内镜活检等操作可能会导致组织损伤，进一步增加了获取组织样本的难度。因此，如何有效地评价肿瘤药物反应就显得尤为重要。
2、然而，传统的循环细胞捕获方法如离心、红细胞裂解、磁珠分离等过程中，细胞的物理和化学因素导致的细胞裂解、细胞损耗、细胞团打碎等会极大地降低细胞的保真度和活性，使这些方法往往只能获得极少量的单细胞，甚至几乎没有团簇。因此，如何提高捕获方法的效率并保证细胞的保真和高活性成为了本领域的一个亟待解决的问题。而当前的循环肿瘤细胞细胞捕获效率极低，且通过离心、磁珠吸附等方式破坏大部分细胞活性以及循环肿瘤细胞的血液微环境，体外培养成功率低，且不能保真的反映体内实际情况，不利于药物反应预测及疾病进展监测。现有的耐药细胞多为组织进行原代二维贴壁培养获得，这些细胞通常没有循环肿瘤细胞的来源，因此其药物反应与循环肿瘤细胞的药物反应存在差异。由于循环肿瘤细胞在真实环境中处于快速流动的血液环境，因此其与实体组织瘤来源的二维贴壁培养细胞的微环境及生存方式存在显著差异。这导致药物在循环肿瘤细胞中的作用与反应原理可能发生改变，因此不能直接将这些细胞作为循环肿瘤细胞药物反应的标准品使用
3、本专利技术的目的在于提供一种针对微环境循环细胞药物敏感性检测方法及试剂盒。
技术实现思路
1、本专利技术的目的提供了一种微环境循环细胞药物敏感性检测试剂盒以及检测方法。
2、进一步，所述试剂盒组分有滤膜，过滤滤装置，培养基，上皮细胞标志物抗体组，免疫细胞标志物抗体组，活细胞染色剂，死细胞染色剂，dapi。
3、进一步，滤膜孔径为8μm，材料为聚对二甲苯，上皮细胞标志物也可以是人epcam，dapi为5mg/ml。
4、进一步，培养基为含有10％胎牛血清的rpmi1640培养基，含100u/ml青霉素，0.1mg/ml硫酸链霉素，0.25μg/ml两性霉素b。
5、进一步，上皮细胞标志物抗体组，包含一抗为小鼠抗人panck抗体，100μg/ml。
6、进一步，免疫细胞标志物抗体组，包含一抗为兔抗人cd45抗体，100μg/ml；活细胞染色剂为calcein-am，200μm；死细胞染色剂为7-aad，200μg/ml；二抗为二抗为山羊抗小鼠igg，1mg/ml。
7、进一步，通过高孔隙率滤膜过滤，提高血液微环境的保存以及循环肿瘤细胞的捕获。
8、进一步，所述捕获细胞包括循环肿瘤相关细胞、循环肿瘤细胞及由这些循环稀有细胞组成的同型或异型细胞簇。
9、进一步，本申请还提供过了一种药物敏感性检测循环肿瘤细胞培养方法，所述培养基为含有7％胎牛血清的rpmi1640培养基，含100u/ml青霉素，0.1mg/ml硫酸链霉素，0.25μg/ml两性霉素b，0.01μg/ml阿奇霉素，0.01％聚乙二醇，0.5μg/ml2-羟基乙胺，0.1μg/ml人重组胰岛素，0.5μg/ml抗坏血酸，0.2mm2-巯基乙醇，0.01μg/ml氢化可的松，0.1μg/ml硫酸锌，终点检测液a为5％mtt溶液，终点检测液b为10mg/ml邻甲苯胺溶液。
10、进一步，离心收集细胞，重悬，富集恶性细胞；离心后上清经过0.22μm滤膜过滤，至于培养基中培养，富集的细胞用该培养基重悬后，于低吸附培养瓶或培养孔板中进行培养。
11、进一步，①此培养基设计兼顾多方面，其一，通过保护并维持细胞三维结构，防止其破碎，例如对细胞外基质(ecm)的三维支架进行保护，这样可以防止主要成分如透明质酸、胶原蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白受到破坏。此外，培养基中添加了基质金属酶抑制剂如多西环素1μg/ml，蛋白酶抑制剂如bestatin2μg/ml，以及氯化钙350μg/ml和左旋糖酐铁10μg/ml，以及抗氧化剂如β-巯基乙醇10μg/ml和维生素e 5μg/ml，目的在于确保细胞间及细胞与ecm间连接的稳定，同时增强其抗压能力。②接着，此培养基能有效维护微环境的原貌，包含多种类型的肿瘤细胞、肿瘤相关的成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞等。这样可以保证化疗药物、靶向药物、靶向肿瘤及血管生发药物(内皮细胞与肿瘤细胞互作)、免疫药物(免疫细胞与肿瘤细胞互作)、内分泌治疗药物(激素相关蛋白酶引起肿瘤细胞增殖)、中药(抗肿瘤以及肿瘤微环境直接互作、代谢互作)等所有肿瘤临床治疗药物及其联合方案的有效使用。③最后，此培养基能降低液体剪应力刺激，减少细胞在培养板上附着的可能性，从而提高了细胞从培养板上脱落的难度。同时，培养基中添加了高分子量的聚(乙二醇)二丙烯酸酯5μg/ml，去乙酰化结冷胶5μg/ml，海藻酸钠5μg/ml，这些物质都能提高培养基的抗组织崩解能力。
12、进一步，本申请还提供了一种循环肿瘤细胞株建模方法:将肺癌细胞细胞进行绿色荧光蛋白gfp的逆转录病毒转染。注射接种于裸小鼠胸腔。60天后取小鼠全血，过滤收集脱落细胞进行二代接种。对耐药建模组和对照组分别给予顺铂(5mg/kg/周)治疗。30天后再次取小鼠全血并过滤收集脱落细胞。通过流式分选获得顺铂耐药和敏感的胸水细胞株。将细胞株以100cell/管冻存于液氮保种。使用以下方法对冻存的细胞株进行复苏：取一冻存管，放入37℃水浴中进行快速溶解。使用700rpm×2min离心，弃去冻存液。用1ml 10％fbs的rpmi1640培养基重悬于低吸附24孔培养板。将复苏液置于37℃5％ co2培养箱中培养过夜。药敏检测,在复苏后的细胞株上，我们将按照以下方案进行药敏检测：加入顺铂10、20μg/ml、顺铂10μg/ml+培美曲塞10μg/ml。继续培养72小时后进行终点检测。
13、进一步，血液经过高效膜过滤，揭下滤膜于6孔板进行培养，加入药物孵育48h，取出滤膜进行免疫荧光标记染色。通过死活细胞标志物进行死细胞和活细胞荧光染色，上皮细胞抗体标记上皮细胞，cd45抗体标记免疫细胞，最终以dapi进行细胞核染色。正置荧光显微镜下进行计数并成像，分别计上皮标志的活细胞和死细胞数量，对照孔作为参照计算药物对活死细胞比例的抑制率，所述敏感性检测包括以下药物：化疗药，靶向药，免疫药及联用药物组合方案。...
【技术保护点】
1.一种微环境循环细胞药物敏感性检测试剂盒，特征在于，所述试剂盒组分有滤膜、过滤滤装置、培养基及上皮细胞标志物抗体组、免疫细胞标志物抗体组、活细胞染色剂、死细胞染色剂、DAPI；
2.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述滤膜孔径为8μm，材料为聚对二甲苯，上皮细胞标志物是人EpCam。
3.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述DAPI为5mg/mL。
4.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述上皮细胞标志物抗体组包含一抗为小鼠抗人panCK抗体100μg/mL。
5.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述免疫细胞标志物抗体组包含一抗为兔抗人CD45抗体100μg/mL；活细胞染色剂为Calcein-AM200μM；死细胞染色剂为7-AAD200μg/mL；二抗为二抗为山羊抗小鼠IgG1mg/mL。
6.一种微环境循环肿瘤细胞捕获方法，特征在于：通过高孔隙率滤膜过滤捕获细胞包括循环肿瘤相关细胞、循环肿瘤细胞及由这些循环稀有细胞组成的同型或异型细胞簇。
7.一种微环境循环细胞药物敏感性检测方法，特征在
8.根据权利要求7的循环细胞药物敏感性检测方法，特征在于：所述的药物敏感性检测为cutoff值单浓度的药物反应测定，具体包括：
9.根据权利要求7的循环细胞药物敏感性检测方法，其特征在于：在培养基中加入化疗药，靶向药，免疫药及联用药物组合方案药物组合。
...【技术特征摘要】
1.一种微环境循环细胞药物敏感性检测试剂盒，特征在于，所述试剂盒组分有滤膜、过滤滤装置、培养基及上皮细胞标志物抗体组、免疫细胞标志物抗体组、活细胞染色剂、死细胞染色剂、dapi；
2.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述滤膜孔径为8μm，材料为聚对二甲苯，上皮细胞标志物是人epcam。
3.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述dapi为5mg/ml。
4.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述上皮细胞标志物抗体组包含一抗为小鼠抗人panck抗体100μg/ml。
5.根据权利要求1的检测剂盒，特征在于，所述免疫细胞标志物抗体组包含一抗为兔抗人cd45抗体100μg/ml；活...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆重益，刘星，齐慧，阚震，翟鹏，唐美娟，
申请(专利权)人：安泰康生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：
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