本发明专利技术涉及一种ＨＬＡ抗体特异性检测方法及细胞盘与试剂盒，属于免疫检测领域。一种ＨＬＡ抗体特异性检测方法，步骤如下：（１）待测血清分别与取自不同供体的外周血淋巴细胞进行抗体抗原反应，（２）检测抗体抗原反应的结果，（３）数据处理获得ＨＬＡ抗体特异性；其特征在，通过对所取供体的选择来达到调整ＨＬＡ抗原频率，使得测出来的ＰＲＡ值比待测血清ＰＲＡ值低，从而减少了由于ＨＬＡ抗原重叠现象对ＨＬＡ抗体特异性检测带来的限制，使本方法能够检测具有更高ＰＲＡ值血清的ＨＬＡ抗体特异性，且能够对待测血清进行一次性筛查其ＨＬＡ抗体特异性，使ＨＬＡ抗体特异性检测方法向前跨越式地进步，造福大众。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学检测方法及试剂，特别是一种HLA抗体特异性检测方法及细胞盘 与试剂盒。
技术介绍
在临床医学上，一些疾病会引发肾脏病变，当病人的肾脏疾病发展到只能依靠透 析来维持生命时，则称其为终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)。对于终末期肾 病病人，肾移植是一种长期有效的治疗方法。人们在进行器官移植的研究中发现，与移植 有关的抗原为HLA-I类和-II类抗原，如表1所示，为目前HLA配型中需要做配型检测五 个HLA基因位点的HLA抗原即HLA-A， _B， -Cw， -DR， -DQ位点的HLA抗原(R. Holdsworth， C. K. Hurley, S. G. E. Marsh， M. Lau， H. J. Noreen， J. H. Kempenich， M. Setterholm and M.Maiers，The HLAdictionary 2008 :a summary of HLA_A，_B，_C，_DRB1/3/4/5，and_DQBl alleles and theirassociation with serologically defined HLA—A，_B，_C，_DR，and_DQ antigens, Tissue Antigens(73)， 95-170， 2009))。 表1 :HLA抗原表(HLA-A， _B， _Cw， _DR， _DQ位点) HLA-AHLA-BHLA-B (连续上一列)HLA-CwHLA-DRHLA-DQ15531112754210323855323912564341013575451114586561915597672316608782417619892518621093<table>table see original document page 4</column></row><table> 由于输血和妊娠等原因，在暴露于异体HLA抗原后，病人体液免疫系统可以产生 抗HLA抗体。肾移植初步成功的关键取决于受体血液中是否含有HLA抗体以及HLA抗体的 特异性，即如果患者血液中没有可以识别供者HLA抗原的抗体，则更可能移植成功，因此， 为了保证移植肾的存活，移植前对受体进行HLA抗体特异性检测，不仅是绝对必要的，而且 有助于快速地找到适合的供体肾。准确灵敏的抗体检测分析方法能够预测并杜绝肾移植超急性排斥(hyperacute rejection)的发生，同时也可以显著地降低肾移植术后早期急性排 斥(early acuterejection)的发生。 人们为了提高抗体检测的灵敏性，随着抗体检测生物技术的发展，逐步出现了抗 体抗原吸附剂测定(ELISA)和流式点阵仪(Luminex)两种检测方法。两种检测方法早期 使用从细胞表面获取的HLA抗原，进而过渡到使用人工合成的HLA抗原(recombinant HLA antigen)去检测病人血清中的HLA抗体。目前国外主要使用Luminex xMAP微颗粒外裹人工 合成的单一HLA抗原，在流式点阵仪上检测HLA抗体的特异性。这种方法使用从细胞株获取 的天然HLA抗原(natural HLA antigen)或者使用人工合成的HLA抗原。ELISA和Luminex 两种检测方法的优势是，一次操作可以检测多个待测标本，检测速度相对较快。然而，使用 从细胞株提取的天然抗原或者使用人工合成抗原进行抗体检测也存在一些缺点。第一，从 细胞株提取的天然抗原或者人工合成抗原黏贴到微颗粒表面和培养孔表面后，抗原的立体 空间位置可能改变，直接影响到抗体识别抗原的灵敏性；第二，不同的微颗粒和培养孔表面 人工合成抗原浓度很难保持相同，致使反应强度无法一致；第三，在从获取细胞株天然抗原 或者制作人工合成抗原过程中，HLA抗原蛋白出现部分降解，裸露的非正常结构可以产生非 特异性抗体结合；第四，人工合成抗原中氨基酸三维折叠形式的细微改变，也可以影响抗体 对抗原的识别。以上诸多缺陷，致使两种方法的检测结果中存在着一些临床上无法解释的 问题，这就要求在HLA抗体检测领域内尽快建立一种创新的以正常细胞为载体、以未加改 变的天然抗原为基础的抗体特异性检测方法。 众所周知，天然抗原存在于有核细胞表面，其中最易获得的是T淋巴细胞和B淋巴 细胞，其中T淋巴细胞表面携带I类HLA抗原，B淋巴细胞表面携带I类和11类两种HLA抗 原。在HLA抗体检测发展过程中，惟一使用以淋巴细胞为载体和天然抗原的检测方法是补 体依赖型淋巴细胞毒实验方法(complement-d印endent cytotoxicity, CDC)。在临床上，该 方法使用至今已经有几十年的历史了。在进行CDC测试时，待测血清中的HLA抗体能够识别 淋巴细胞表面上的HLA抗原；通过补体的协同作用，可以杀伤淋巴细胞，进而依据细胞杀伤 程度来判断抗体的特异性。然而，CDC检测方法存在三大致命问题。第一，根据补体介导的 抗原抗体反应原理，依据显微镜下观察死亡淋巴细胞和正常细胞的比例，以判断抗体的存 在，得出的抗体特异性非常局限，且当抗体浓度低时，病人虽然已被致敏但是没有足够的抗 体量去杀死淋巴细胞，因此会得出假阴性结果，致使CDC方法的灵敏性较差；而在实际的肾 移植过程中，只要患者体内存在抗移植物的HLA抗体，移植后HLA抗体浓度可以迅速上升， 就很可能会引起急性排斥反应；第二，使用CDC方法检测HLA抗体时，由于大量高频率抗原 的存在，细胞目录中存在大量抗原重叠(antigen masking)现象，即由于一些抗原的频率非 常高，会导致细胞目录中大多数细胞反应呈阳性，这些阳性反应的细胞上还有其他HLA抗 原，如果待测血清中含有多种HLA抗体时，呈阳性反应的细胞几乎占满整个细胞目录，CDC 检测方法就无法找出抗体的特异性，因为其它低频率的HLA抗原会被高频率抗原的阳性反 应所掩盖；第三，CDC方法是通过补体介导的抗原抗体反应原理，显微镜下观察死亡淋巴细 胞的比例，以判断抗体的存在，而I类和II类抗体同时存在时，不能检测出II类抗体，同时 要求细胞目录中的细胞必须是活细胞，否则难以测出阳性反应，因此细胞一旦丧失活性，就 会导致检测假阴性。 HLA抗体特异性包括针对单一HLA抗原的抗体和针对交叉反应组(crossreactive group, CREG)的抗体。Takemoto等(1994)提出交叉反应组配型的概念，即由 于某些HLA抗原氨基酸分子结构相近，HLA抗原分子之间具有公共抗原决定簇，可与同一 种HLA抗体发生交叉反应，这些与同一种HLA抗体发生反应的HLA抗原决定簇称为交叉反 应组；目前常规检测的I类HLA抗原可归纳为9个交叉反应组，如表2所示，摘自(Gle皿 E. Rodey，HLA beyondtears :introduction to human histocompatibility'', the third and fourth ch即ters，2nd edition, 2000)。 表2交叉反应组类型及各组所包含的抗原 <table>table see 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＨＬＡ抗体特异性检测方法，步骤如下： （１）待测血清分别与取自不同供体的外周血淋巴细胞进行抗体抗原反应， （２）检测抗体抗原反应的结果， （３）数据处理获得ＨＬＡ抗体特异性； 所述外周血淋巴细胞包含Ｔ淋巴细胞和Ｂ淋巴细胞，所述淋巴细胞携带的ＨＬＡ抗原包含ＨＬＡ－Ａ，－Ｂ，－Ｃｗ，－ＤＲ，－ＤＱ位点的所有ＨＬＡ抗原，所述ＨＬＡ抗原的发生频率为：每种ＨＬＡ抗原至少出现在两份供体细胞中，其中Ｂｗ４所附属的供体占供体总份数的５０－５５％，Ｂｗ６占５０－５５％，Ａ１占１０－１５％，Ａ２占２５－３０％，Ａ３占１５－１９％，Ａ１１占５－１５％，Ａ２４占１０－２０％，Ｃｗ７占２５－３０％，Ｃｗ９占２０－２５％； 所述数据处理指，依次记录所有供体的ＨＬＡ抗原类型及其抗原抗体反应结果，比较阴性反应供体与阳性反应供体所包含的ＨＬＡ抗原，在阳性反应供体所包含的ＨＬＡ抗原中扣除阴性反应供体所包含的ＨＬＡ抗原，再将余下的阳性反应供体所包含的Ⅰ类ＨＬＡ抗原与９种交叉反应组比较，找出所剩下的阳性反应供体覆盖的Ⅰ类ＨＬＡ抗原所包括的交叉反应组；再将余下的阳性反应孔所覆盖的Ⅱ类ＨＬＡ抗原与单一Ⅱ类ＨＬＡ抗原进行比较。...
【技术特征摘要】
一种HLA抗体特异性检测方法，步骤如下(1)待测血清分别与取自不同供体的外周血淋巴细胞进行抗体抗原反应，(2)检测抗体抗原反应的结果，(3)数据处理获得HLA抗体特异性；所述外周血淋巴细胞包含T淋巴细胞和B淋巴细胞，所述淋巴细胞携带的HLA抗原包含HLA-A，-B，-Cw，-DR，-DQ位点的所有HLA抗原，所述HLA抗原的发生频率为每种HLA抗原至少出现在两份供体细胞中，其中Bw4所附属的供体占供体总份数的50-55％，Bw6占50-55％，A1占10-15％，A2占25-30％，A3占15-19％，A11占5-15％，A24占10-20％，Cw7占25-30％，Cw9占20-25％；所述数据处理指，依次记录所有供体的HLA抗原类型及其抗原抗体反应结果，比较阴性反应供体与阳性反应供体所包含的HLA抗原，在阳性反应供体所包含的HLA抗原中扣除阴性反应供体所包含的HLA抗原，再将余下的阳性反应供体所包含的I类HLA抗原与9种交叉反应组比较，找出所剩下的阳性反应供体覆盖的I类HLA抗原所包括的交叉反应组；再将余下的阳性反应孔所覆盖的II类HLA抗原与单一II类HLA抗原进行比较。2. 根据权利要求l所述的检测方法，所述步骤(2)检测抗原抗体反应的结果采用荧光 素标记抗体抗原反应中的淋巴细胞。3. 根据权利要求2所述的检测方法，所述荧光素标记抗原抗体反应中的淋巴细胞指加 入荧光素异硫氰酸标记的二抗和分别特异性标记T淋巴细胞和B淋巴细胞的两种荧光标记 抗体；所述两种荧光标记抗...
【专利技术属性】
技术研发人员：才新，
申请(专利权)人：同昕生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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