【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及用于在预选位置编辑基因组序列和用于调节基因表达的组合物和方法。关于通过efs-web以文本文件形式提交的序列表序列表的正式文本通过efs-web以按照美国信息交换标准码(ascii)的文本文件与说明书同时提交，文件名为bhp017p5 sequence listing_st25.txt，创建日期为2018年8月3日，大小为1,848kb。通过efs-web提交的该序列表是本说明书的一部分且通过引用全文纳入本文。
技术介绍
1、基因组dna的修饰对于基础和应用研究是极其重要的。基因组修饰有可能说明并且在一些情况中疗愈病因，以及在包括此类修饰的个体和/或细胞中提供所需特性。基因组修饰可以包括例如植物、动物、真菌的修饰，和/或原核基因组修饰。修饰基因组dna的最常用方法趋向于在基因组内的随机位点修饰dna，但是最近的发现使位点特异性基因组修饰成为可能。此类技术依赖于在所需位点上产生dsb。该dsb导致将宿主细胞的原生dna修复机制募集到dsb。可以控制dna修复机制，以在预定位点插入异源性dna，以使原生植物基因组dna缺失，或以在所需位点生成点突变、插入或缺失。对于位点特异性基因组修饰特别感兴趣的是成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)核酸酶。crispr核酸酶使用引导分子，通常是引导rna分子，它与核酸酶相互作用并且与靶向的dna碱基配对，从而允许核酸酶在所需位点产生双链断裂(dsb)。dsb的产生要求原型间隔子-邻近基序(pam)序列的存在；在pam序列的识别之后，crispr核酸酶能够产生所需ds
2、实施基因组修饰的一个领域是植物基因组dna的修饰。植物基因组dna的修饰对于基础和应用植物学研究是极其重要的。具有稳定修饰的基因组dna的转基因植物可以具有新的性状，如除草剂耐受，抗虫性，和/或积累有价值蛋白质，包括它们提供的药用蛋白质和工业酶。原生植物基因的表达可能会被上调或下调或以其他方式改变(例如，通过改变表达原生植物基因的组织)，它们的表达可能会被完全消除，dna序列可能会被改变(例如，通过点突变、插入或缺失)，或新的非原生基因可能会被插入植物基因组，从而将新的性状赋予植物。
技术实现思路
1、提供了使用cms1 crispr系统进行基因组dna序列修饰的组合物和方法。本文所用基因组dna表示线性和/或染色体dna和/或感兴趣的一种或多种细胞中存在的质粒或其它染色体外dna序列。该方法在基因组dna序列中的预定靶位点生成双链断裂(dsb)，在基因组中的靶位点导致dna序列的突变、插入和/或缺失。组合物包括dna构建体，其包括编码csm1蛋白的核苷酸序列，其操作性连接至在感兴趣细胞中可操作的启动子。在一些实施方式中，cms1蛋白包含选自下组的至少一个氨基酸基序：seq id no:177-186。在其它实施方式中，cms1蛋白包含选自seq id no:288-289和187-201的至少一个氨基酸基序。在其它实施方式中，cms1蛋白包含选自下组的至少一个氨基酸基序：seq id no:290-296。在某些优选的实施方式中，cms1蛋白包含选自下组的多于一个氨基酸基序：seq id no:177-186。在某些优选的实施方式中，cms1蛋白包含选自下组的多于一个氨基酸基序：seq id no:288-289和187-201。在某些优选的实施方式中，cms1蛋白包含选自下组的多于一个氨基酸基序：seqid no:290-296。具体的cms1蛋白序列列于seq id no:10、11、20-23、30-69、154-156、208-211和222-254；具体的cms1蛋白编码多核苷酸序列列于seq id no:16-19、24-27、70-146、174-176、212-215和255-287。在某些优选的实施方式中，cms1蛋白与选自下组的序列具有至少80％的相同性：seq id no:16-19、24-27、70-146、174-176、212-215和255-287。包含编码本专利技术的cms1蛋白的多核苷酸序列的dna构建体或本专利技术的cms1蛋白本身可用于在预定的基因组基因座上指导基因组dna的修饰。本文描述了使用这些dna构建体来修饰基因组dna序列的方法。本文还涵盖经修饰的真核生物和真核细胞，包括酵母，变形虫，昆虫，真菌，哺乳动物，植物，植物细胞，植物部分和种子，以及经修饰的原核生物，包括细菌和古细菌。还提供了用于调节基因表达的组合物和方法。该方法靶向蛋白质至基因组中预定位点以实现上调或下调一种或多种基因，其表达由基因组中靶向的位点调节。组合物包括含有核苷酸序列的dna构建体，所述核苷酸序列编码具有减弱或消失的核酸酶活性的修饰的csm1蛋白，任选地融合转录激活或抑制结构域。本文描述了使用这些dna构建体来修饰基因表达的方法。
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1.一种在动物细胞、真菌细胞或原核细胞的基因组的靶位点处修饰核苷酸序列的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸序列包括细胞基因组中异源性DNA的插入、细胞基因组中核苷酸序列的缺失，或细胞基因组中至少一个核苷酸的突变。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸序列包括多核苷酸的插入，所述多核苷酸编码使转化的细胞具有抗生素耐受性的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述基因组是核或线粒体基因组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述编码Cms1多肽的多核苷酸经密码子优化以在细胞中表达。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述gRNA是靶向DNA的RNA。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是动物细胞，并且其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
9.一种核酸分子，其包含多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列：(i)与SEQ ID NO:16-1
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述启动子在动物细胞中有活性，并且其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
11.根据权利要求9或10所述的核酸分子，其中所述多核苷酸序列由SEQ ID NO:16-19、24-27、70-146、174-176、212-215和255-287中任一所示，或者其中所述多核苷酸序列编码Cms1多肽，所述Cms1多肽包含SEQ ID NO:10、11、20-23、30-69、154-156和222-254中任一所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求9或10所述的核酸分子，其中所述Cms1多肽经突变以减低或消除核酸酶活性。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中当以最大相同性比对时，所述经突变的Cms1多肽在在对应于SmCms1(SEQ ID NO:10)的701或922位的位置或对应于SulfCms1(SEQ IDNO:11)的848和1213位的位置包含突变。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的核酸分子，其中所述编码Cms1多肽的多核苷酸序列经密码子优化以在细胞中表达。
15.一种动物细胞、真菌细胞或原核细胞，其包含：
16.根据权利要求15所述的细胞，其中(a)的所述Cms1多肽包含由SEQ ID NO:10、11、20-23、30-69、154-156和222-254中任一所示的氨基酸序列，或者其中(a)的所述多核苷酸序列由SEQ ID NO:16-19、24-27、70-146、174-176、212-215和255-287中任一所示。
17.根据权利要求15所述的细胞，其中(b)的所述多核苷酸序列由SEQ ID NO:16-19、24-27、70-146、174-176、212-215和255-287中任一所示，或者(b)的所述多核苷酸序列编码包含由SEQ ID NO:10、11、20-23、30-69、154-156和222-254中任一所示的氨基酸序列的Cms1多肽。
18.根据权利要求15所述的细胞，其中所述Cms1多肽经突变以减低或消除核酸酶活性。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中当以最大相同性比对时，所述经突变的Cms1多肽在在对应于SmCms1(SEQ ID NO:10)的701或922位的位置或对应于SulfCms1(SEQ ID NO:11)的848和1213位的位置包含突变。
20.一种动物细胞、真菌细胞或原核细胞，包含融合蛋白，其包含：
21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述异源性多肽包含效应物结构域，所述效应物结构域选自下组：切割结构域、表观遗传修饰结构域、转录活化结构域和转录阻遏物结构域。
22.根据权利要求20或21所述的细胞，其中所述融合蛋白还包含核定位信号、质体信号肽、线粒体信号肽、能够运输蛋白质至多个亚细胞位置的信号肽、细胞穿透结构域或标志物结构域。
23.一种核糖核蛋...
【技术特征摘要】
1.一种在动物细胞、真菌细胞或原核细胞的基因组的靶位点处修饰核苷酸序列的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸序列包括细胞基因组中异源性dna的插入、细胞基因组中核苷酸序列的缺失，或细胞基因组中至少一个核苷酸的突变。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸序列包括多核苷酸的插入，所述多核苷酸编码使转化的细胞具有抗生素耐受性的蛋白质。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞的所述基因组是核或线粒体基因组。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述编码cms1多肽的多核苷酸经密码子优化以在细胞中表达。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述grna是靶向dna的rna。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述细胞是动物细胞，并且其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
9.一种核酸分子，其包含多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列：(i)与seq id no:16-19、24-27、70-146、174-176、212-215和255-287中任一具有至少90％相同性，并且编码具有内切核酸酶活性的cms1多肽；或(ii)编码氨基酸序列与seq id no:10、11、20-23、30-69、154-156和222-254中任一具有至少90％序列相同性且具有内切核酸酶活性的cms1多肽，其中所述多核苷酸序列操作性地连接至与所述多核苷酸序列异源且在动物细胞、真菌细胞或原核细胞中有活性的启动子。
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其中所述启动子在动物细胞中有活性，并且其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
11.根据权利要求9或10所述的核酸分子，其中所述多核苷酸序列由seq id no:16-19、24-27、70-146、174-176、212-215和255-287中任一所示，或者其中所述多核苷酸序列编码cms1多肽，所述cms1多肽包含seq id no:10、11、20-23、30-69、154-156和222-254中任一所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求9或10所述的核酸分子，其中所述cms1多肽经突变以减低或消除核酸酶活性。
13.根据权利要求12所述的核酸分子，其中当以最大相同性比对时，所述经突变的cms1多肽在在对应于smcms1(seq id ...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·贝其曼，B·N·格雷，
申请(专利权)人：本森希尔股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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