【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生化，具体涉及一种高效低毒细胞转染试剂及其应用。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、细胞转染是一种将外源性的遗传物质导入至目标细胞内的一种技术。随着生物技术的发展，基因编辑技术、基因沉默技术、mrna技术均需要通过细胞转染将所研究的遗传物质导入目标细胞内进行相关的研究。细胞转染的方法多种多样，目前常用的细胞转染方法有以下几种：
3、(1)磷酸钙产沉淀法，该方法将遗传物质与该磷酸盐混合形成沉淀复合物，再将该复合物与细胞共同孵育，细胞将复合物吞噬后可以达到一定的转染效果。
4、(2)电穿孔法，该方法利用特殊的装置，使用高压电瞬间将细胞膜破坏产生孔洞，遗传物质通过细胞膜上产生的孔洞进入细胞内，实现转染。
5、(3)病毒介导的转染，该方法使用病毒载体将目标基因片段导入细胞内，因为病毒具有较高的转染效率，该方法广泛地应用在car-t领域。
6、(4)脂质纳米颗粒转染法，遗传物质被脂质材料包裹形成脂质纳米颗粒后再与细胞共同孵育，从而将遗传物质导入细胞内。
7、相比于其他转染方法，脂质纳米颗粒法可修饰性强，可以通过穿膜肽、靶向分子等修饰技术提高细胞转染的效率。作为实现核酸药物有效递送的最佳方法之一，脂质纳米颗粒转染法已受到业界认可。当然，不可否认的是，脂质纳米颗粒转染法的转染效率低和毒性等缺点仍需要改善。例如，专利cn
8、因此，研发一种低毒、快速、高效的细胞转染试剂具有重要意义。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种高效低毒细胞转染试剂及其应用，本专利技术公开了一种低毒、快速、高效的转染试剂，可适用于贴壁、半贴壁、悬浮细胞的快速高效转染，也可以转染t细胞、nk细胞等难以转染的免疫医细胞。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
3、本专利技术的第一个方面，提供一种高效低毒细胞转染试剂，其由a液和b液组成，a液为柠檬酸缓冲溶液或醋酸缓冲溶液，b液为脂质复合物；
4、所述脂质复合物由阳离子或者可电离脂质、胆固醇、两亲性脂质和dope-la混合而成；
5、所述dope-la的结构如下所示：
6、
7、商业化的转染试剂，例如lipo2000和lipo3000等，是通过电荷作用与细胞表面相互作用，促进细胞的内吞，由于正电荷的转染试剂对细胞具有较大的毒性，因此此类商业化的转染试剂受限于毒性问题，对于原代细胞以及细胞活力较弱的细胞转让时存在一定的局限性。为提高转染效率，降低毒性，本专利技术针对细胞表面广泛存在的巯基，设计了可以与细胞表面巯基形成二硫键的转染试剂。细胞表面的巯基主要存在于细胞表面的蛋白上，多以半胱氨酸残基的形式存在，其中一部分半胱氨酸的残基相互形成二硫键，未成键的巯基则与转染试剂形成二硫键，进而促进被转染细胞的摄取。
8、本专利技术提供的高效低毒细胞转染试剂是作用于细胞表面巯基，由于细胞表面巯基可以依靠细胞内的氧化还原过程重新产生，因此该转染试剂具有优异的安全性以及极高的转染效率。
9、在本专利技术到一些实施例中，所述a液的浓度为2mm-20mm，ph值为3.0-4.5。
10、在本专利技术到一些实施例中，所述阳离子或可电离脂质包括alc-0315、sm-102、dlindma、dodma、dlin-mc2-mpz、dlin-kc2-dma、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)、c12-200、dc-chol和1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)(dotma)中的至少一种。
11、在本专利技术到一些实施例中，所述两亲性脂质包括peg-dmg、peg2000-c-dmg、聚乙二醇-碳14(peg-c14)、peg-c-dma、peg-dspe、peg-pe、peg修饰的神经酰胺、peg修饰的二烷基胺、peg修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、peg-dpg、peg-s-dmg、聚乙二醇二丙烯酸酯(peg-daa)、丙烯酸-n,n-二甲胺基乙酯(daa)、peg-c-domg和galnac-peg-dsg中的至少一种。
12、在本专利技术到一些实施例中，所述脂质复合物中各组分的比例为：阳离子或者可电离脂质、胆固醇、两亲性脂质、dope-la的摩尔比为(20～70):(20～60):(1～5):(5～40)。
13、优选的，所述脂质复合物中各组分的比例为：阳离子或者可电离脂质、胆固醇、两亲性脂质、dope-la的摩尔比为(30～60):(35～50):(1.5～3.5):(10～30)。
14、在本专利技术到一些实施例中，所述高效低毒细胞转染试剂转染的货物分子为核酸分子。
15、在本专利技术到一些实施例中，所述核酸分子是dna、sirna、mrna、环状rna、dsrna、sarna、反义核酸(aso)、微rna、反义微rna、antagomir、微rna抑制剂、微rna激活剂和免疫刺激性核酸中的一种或两种以上的组合。
16、在本专利技术到一些实施例中，所述dope-la的合成方法包括如下步骤：
17、将硫辛酸溶解于有机溶剂中，搅拌溶解，加入羰基二咪唑室温避光搅拌，加入二油酰基磷酰乙醇胺，避光于25-35℃下反应20-25h。反应结束后除去有机溶剂，柱层析得到dope-la；
18、所述硫辛酸、羰基二咪唑和二油酰基磷酰乙醇胺的当量比为(0.9-1.1):(1.0-1.2):(0.7-0.9)。
19、本专利技术的第二个方面，提供一种第一个方面所述的高效低毒细胞转染试剂在细胞转染中的应用。
20、在本专利技术到一些实施例中，所述细胞包括贴壁细胞、半悬浮细胞以及悬浮细胞。
21、优选的，所述细胞包括但不限于人非小细胞肺癌细胞(a549细胞)、人t淋巴细胞白血病细胞(jurkat细胞)、人肝癌细胞(hep g2细胞)等。
22、本专利技术的第三个方面，提供一种细胞转染的方法，采用第一个方面所述的高效低毒细胞转染试剂转染细胞，包括如下步骤：使用a液将核酸分子配置成0.008-0.012mg/ml的溶液，再将该溶液与b液按照1:2-6的体积比快速混合，得到溶液c；将溶液c与待转染的细胞共培育15-60min即可。
23、本专利技术通过脂质的复配，提高转染试剂的稳定性，可使用涡旋混合仪将核算溶液和b液快速混合即可在pbs孵育的细胞中进行转染操作。可转染的细胞种类多，且转染时本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，其由A液和B液组成，A液为柠檬酸缓冲溶液或醋酸缓冲溶液，B液为脂质复合物；
2.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述A液的浓度为2mM-20mM，pH值为3.0-4.5。
3.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述阳离子或可电离脂质包括ALC-0315、SM-102、DLinDMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、C12-200、DC-Chol和1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)中的至少一种。
4.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述两亲性脂质包括PEG-DMG、PEG2000-C-DMG、PEG-C14、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、PEG-DPG、PEG-s-DMG、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酸-N,N-二甲胺基乙酯、PEG-c-DOMG和GalNAc-
5.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述脂质复合物中各组分的比例为：阳离子或者可电离脂质、胆固醇、两亲性脂质、DOPE-LA的摩尔比为(20～70):(20～60):(1～5):(5～40)。
6.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述高效低毒细胞转染试剂转染的货物分子为核酸分子；
7.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述DOPE-LA的合成方法包括如下步骤：
8.一种权利要求1-7任一所述的高效低毒细胞转染试剂在细胞转染中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞包括贴壁细胞、半悬浮细胞以及悬浮细胞。
10.一种细胞转染的方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一所述的高效低毒细胞转染试剂转染细胞，包括如下步骤：使用A液将核酸分子配置成0.008-0.012mg/mL的溶液，再将该溶液与B液按照1:2-6的体积比快速混合，得到溶液C；将溶液C与待转染的细胞共培育15-60min即可；
...【技术特征摘要】
1.一种高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，其由a液和b液组成，a液为柠檬酸缓冲溶液或醋酸缓冲溶液，b液为脂质复合物；
2.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述a液的浓度为2mm-20mm，ph值为3.0-4.5。
3.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述阳离子或可电离脂质包括alc-0315、sm-102、dlindma、dodma、dlin-mc2-mpz、dlin-kc2-dma、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、c12-200、dc-chol和1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)中的至少一种。
4.如权利要求1所述的高效低毒细胞转染试剂，其特征在于，所述两亲性脂质包括peg-dmg、peg2000-c-dmg、peg-c14、peg-c-dma、peg-dspe、peg-pe、peg修饰的神经酰胺、peg修饰的二烷基胺、peg修饰的二酰基甘油、吐温-20、吐温-80、peg-dpg、peg-s-dmg、聚乙二醇二丙烯酸酯、丙烯酸-n,n-二甲胺基乙酯、peg-c-domg和g...
【专利技术属性】
技术研发人员：张岱州，薛松，李大伟，杨雪华，刘正平，毛楷凡，庄婕，张小刚，於怀龙，樊志萍，
申请(专利权)人：山东省药学科学院，
类型：发明
国别省市：
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