一种产生雄性不育小鼠模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种雄性不育小鼠模型、建立该雄性不育小鼠模型的方法，以及该雄性不育小鼠模型的用途。在本发明专利技术的雄性不育小鼠模型中，已从基因组中剔除Ｋｉｆ１８ａ基因或在Ｋｉｆ１８ａ基因中插入外源基因而导致Ｋｉｆ１８ａ基因失活。该雄性不育动物模型的遗传稳定、表型稳定，可用于精子发生发育机制研究、精子发育相关基因研究、精原干细胞移植及精子发生重建、生殖细胞的迁移和分化研究、筛选新型生殖不育和计划生育相关药物等应用领域。

【技术实现步骤摘要】
一种产生雄性不育小鼠模型的方法
本专利技术涉及转基因
更具体地，涉及一种雄性不育小鼠模型、建立该雄性不育小鼠模型的方法，以及该雄性不育小鼠模型的用途。
技术介绍
精子发生的正常维持不但依赖睾丸生殖细胞与支持细胞间密切的联系，而且也有赖于位于曲细精管基底膜内精原干细胞(SSCs)的正常自增值和分化，正常动物(包括人)的SSCs即能增值产生新的干细胞，也能发育分化为各级生精细胞。SSCs产生新的干细胞与分化细胞之间的比例依赖于特定的生理及环境条件，有许多基因参与生殖细胞的增值和分化(诸如Vasa，Znf，Kssk，c-KIT等)。个体可因缺乏SSCs，生精细胞发育阻断，或产生无功能性精子等原因而造成不育。精子的发生发育方面的研究已有很多的报道，但其发生发育的调控机理仍然存在不少的谜团，生精相关基因的功能及其相互之间的关系研究多数围绕着现象观察和描述方面，精子的发生发育机理的研究、雄性不育治疗方法，避孕药物的研发都需要有相应的动物模型才能深入展开。迄今为止，适合研究精子发生发育相关的动物模型为数极少。生精障碍小鼠模型为少数用于精子发育机理研究的模型之一。目前，人为产生生精障碍动物模型特别是雄性小鼠不育模型主要通过给小鼠注射或喂食busulfan(白消安，即甲磺酸丁二醇二酯，为一种烷基化试剂，临床上主要用于对髓系白血病的治疗)药物，诱发精原干细胞凋亡而产生，这种小鼠模型的制作过程周期长，需要小鼠的数量大，在轻剂量作用下，残留的少量内源性干细胞能重新启动精子发生；大剂量下，往往由于药物严重的副作用，不仅造成精原干细胞的凋亡，同时能引起其他胚胎干细胞包括血液干细胞的凋亡缺失，伴有出血、泡疹、抽筋、腹泻、恶心、呕吐、呼吸困难、降低机体免疫力、怀孕小鼠产子缺陷等，另外还可造成机体产生其他癌变比如白血病的危险性，从而影响小鼠整体的生长发育，为此后的研究工作带来不利的影响，-->这种人为产生的动物模型不尽如人意。因此，本领域迫切需要开发遗传稳定、表型稳定的雄性不育动物模型，以便用于生殖发生发育及机理研究。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种用于建立遗传稳定、表型稳定的雄性不育小鼠模型的方法，以及用于该方法的转基因小鼠模型。本专利技术的另一目的是提供该雄性不育小鼠模型的用途。在本专利技术的第一方面，提供了一种产生雄性不育的非人哺乳动物的方法，它包括步骤：(a)通过从基因组中剔除Kif18a基因或在Kif18a基因中插入外源基因，产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物的受精卵；(b)将步骤(a)中的受精卵再生成非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中Kif18a基因由于剔除或插入外源基因而失活。在另一优选例中，所述的步骤(b)是将步骤(a)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管，然后产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的步骤(a)是通过在Kif18a基因中插入PLAG1-EGFP融合基因。在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(c)对步骤(b)获得的非人哺乳动物进行鉴定。在另一优选例中，在步骤(b)还包括对获得的非人哺乳动物进行交配建系，获得子代。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猴。在另一优选例中，步骤(b)中的非人哺乳动物是纯合的，即基因组中的两个Kif18a基因都由于剔除或插入外源基因而失活。在本专利技术第二方面，提供了用一种因从基因组中剔除Kif18a基因或在Kif18a基因中插入外源基因而产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物是一种雄性不育动物。更佳地，所述的动物是用本专利技术上述方法制备的。在本专利技术第三方面，提供了一种本专利技术所述的非人哺乳动物的用途，它被-->用作雄性不育模型。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是小鼠或大鼠。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物是纯合的，即基因组中的两个Kif18a基因都由于剔除或插入外源基因而失活，并且是雄性。附图说明图1显示了组织非特异性表达质粒pCMV-EGFP/PLAG1的结构图。图2显示了对kif18a缺失小鼠基因型的PCR鉴定结果。野生型小鼠基因组扩出942bp带，纯合子小鼠扩出559bp带，杂合子小鼠扩出942bp、559bp两条带。图3显示了12周龄kif18a-/-、kif18a+/+雄性小鼠睾丸HE染色切片分析结果。野生型小鼠睾丸曲细精管有大量的各级生精细胞及精子，而kif18a缺失纯合小鼠曲细精管各级生精细胞缺失，无精子存在，曲细精管间质细胞增生。具体实施方式本专利技术人经过深入而广泛的研究，建立了一种遗传稳定、表型稳定的雄性不育模型，它是由于kif18a基因被剔除或在Kif18a基因中插入外源基因而失活的小鼠或其他非人哺乳动物。本专利技术的不育雄性小鼠为小睾丸，其睾丸曲细精管萎缩，管壁变薄，各级生精细胞缺失，不能产生可育的健康精子，与人类男性不育相似，为人类生殖不育的遗传性动物模型。可用于精子发生发育机制研究、精子发育相关基因研究、精原干细胞移植及精子发生重建、生殖细胞的迁移和分化研究、筛选新型生殖不育和计划生育相关药物等应用领域。在此基础上完成了本专利技术。在本专利技术中，非人哺乳动物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠。如本文所用，术语“kif18a基因”指Genebank登录号为BC016095的基因。应理解，该术语还包括各种天然存在的kif18a基因的变异形式。代表性的例子包括：因密码子的简并性而编码与野生型相同的kif18a蛋白的核苷酸序列，编码野生型kif18a蛋白的保守性变异多肽的核苷酸序列。此外，对于小鼠之外的其他哺乳动物时，该术语指kif18a基因在该哺乳动物中的同系物。例如对于人而言，该术语指人的Kif18a(已知小鼠Kif18a基因与人类Kif18a-->同源76％)。在本专利技术中，“kif18a蛋白的保守性变异多肽”指与野生型kif18a蛋白的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。                    表1  最初的残基  代表性的取代  优选的取代  Ala(A)  Val；Leu；Ile  Val  Arg(R)  Lys；Gln；Asn  Lys  Asn(N)  Gln；His；Lys；Arg  Gln  Asp(D)  Glu  Glu  Cys(C)  Ser  Ser  Gln(Q)  Asn  Asn  Glu(E)  Asp  Asp  Gly(G)  Pro；Ala  Ala  His(H)  Asn；Gln；Lys；Arg  Arg  Ile(I)  Leu；Val；Met；Ala；Phe  Leu  Leu(L)  Ile；Val；Met；Ala；Phe  Ile  Lys(K)  Arg；Gln；Asn  Arg  Met(M)  Leu；Phe；Ile  Leu  Phe(F)  Leu；Val；Ile；Ala；Tyr  Leu  Pro(P)  Ala  Ala  Ser(S)  Thr  Thr  Thr(T)  Ser  Ser  Trp(W)  Tyr；Phe  本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生雄性不育的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤：（ａ）通过从基因组中剔除Ｋｉｆ１８ａ基因或在Ｋｉｆ１８ａ基因中插入外源基因，产生Ｋｉｆ１８ａ基因失活的非人哺乳动物的受精卵；（ｂ）将步骤（ａ）中的受精卵再生成非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中Ｋｉｆ１８ａ基因由于剔除或插入外源基因而失活。

【技术特征摘要】
1.一种产生雄性不育的非人哺乳动物的方法，其特征在于，包括步骤：(a)通过从基因组中剔除Kif18a基因或在Kif18a基因中插入外源基因，产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物的受精卵；(b)将步骤(a)中的受精卵再生成非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中Kif18a基因由于剔除或插入外源基因而失活。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)是将步骤(a)的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管，然后产生Kif18a基因失活的非人哺乳动物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)是通过在Kif18a基因中插入PLAG1-EGFP融合基因。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：(c)对步骤(b)获...

【专利技术属性】
技术研发人员：王铸钢，费俭，任维华，
申请(专利权)人：上海南方模式生物科技发展有限公司，上海南方模式生物研究中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]