【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种污染鸡肉中四环素类抗生素的萃取方法、测定方法，属于兽药残留检测。
技术介绍
1、四环素类抗生素是兽医学中使用最广泛的广谱抗生素之一，包括四环素、土霉素和金霉素等。由于四环素类抗生素具有良好的抗菌活性和低廉的成本，已被世界各国广泛应用于畜牧养殖业中。养殖过程中违反休药期规定，或者过度使用甚至是滥用抗生素，会导致动物源食品中残留抗生素。长期暴露于此类受抗生素污染的食品中，会对人体健康造成不利影响，如过敏反应、肝肾组织损伤、胃肠道功能紊乱等。因此，开发一种准确定量动物源食品中四环素类抗生素残留量的方法显得尤为重要。
2、准确定量动物源食品中四环素类抗生素残留的难点在于动物源食品具有复杂的基质。fedeniuk等人在利用高效液相色谱法测定不同样品基质中土霉素含量时发现，猪肉组织中土霉素的回收率(＜70％)远低于水样中土霉素的回收率(＞90％)，这表明食物基质确实影响四环素类抗生素的检测(j.chromatogr.b，1996，677，291-297)。作者将这一影响因素归于猪肉组织中的主要成分蛋白质与土霉素之间的特殊相互作用。四环素类抗生素具有多个n-和o-基团功能化取代基的结构特征，已被证明具有与蛋白质等生物大分子结合的强烈倾向。目前已开发了多种样品前处理技术来净化样品，以消除蛋白质的干扰。cherlet等人采用有机酸沉淀蛋白，三氯乙酸在高效沉淀蛋白的同时，也将与其结合紧密的四环素类抗生素一同沉淀，导致萃取率过低(＜25％)(anal.chim.acta，2003，492，199-2130)。周茜、朱丽华
3、因此有必要开发能够有效萃取污染鸡肉中四环素类抗生素的方法，并实现污染鸡肉中四环素类抗生素的准确测定。
技术实现思路
1、鉴于现有技术存在的缺陷与不足，本专利技术选取阳性鸡肉样本(含四环素类抗生素)为研究对象，采用菠萝蛋白酶对鸡肉中的蛋白质进行水解，并对酶的种类、用量以及酶解时间进行了优化，实现污染鸡肉中四环素类抗生素的有效萃取。随后，结合液质联用技术，成功地建立了一种准确测量鸡肉样品中四环素类抗生素残留的方法。这一方法克服了现有检测方法中难以萃取与蛋白质结合部分的抗生素的问题，提高了实际鸡肉样品中四环素类抗生素残留的准确定量。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种污染鸡肉样品中四环素类抗生素的萃取方法，所述方法包括先对鸡肉进行酶解得到酶解液，再从酶解液中萃取；其中，所述酶解液的制备包括：将新鲜的鸡肉样品捣碎、匀浆，得到鸡肉匀浆样品，然后加入占鸡肉匀浆样品的质量百分数为6-10％的菠萝蛋白酶、磷酸盐缓冲液，漩涡混匀，水浴振荡处理，得到酶解液。
3、在一种实施方式中，所述的四环素类抗生素包括四环素、土霉素和金霉素。
4、在一种实施方式中，所述的菠萝蛋白酶的添加量为鸡肉样品质量的8-10％；可选地为8％。
5、在一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲液浓度为50mm，ph＝7。
6、在一种实施方式中，所述水浴振荡是在水浴摇床上振荡3-5h。
7、在一种实施方式中，所述水浴振荡是在30-45℃下振荡。
8、在一种实施方式中，所述水浴振荡是在37℃的水浴摇床上振荡3h以上。
9、在一种实施方式中，所述方法还包括：调节所得酶解液的ph，用na2edta-mcllvaine缓冲液超声提取一次以上，离心合并上清液。
10、在一种实施方式中，所述调节所得酶解液的ph是调节ph至4。
11、在一种实施方式中，所述超声提取是提取3次，每次旋涡混合1min，然后在冰水浴中超声提取10min；在3000r/min离心5min后，收集并合并三次萃取的上清液。
12、在一种实施方式中，所述菠萝蛋白酶的酶活力为300u/mg。
13、本专利技术的第二个目的是提供一种测定污染鸡肉中四环素类抗生素残留的方法，所述方法包括：
14、(6)待测样品处理：将新鲜的鸡肉样品捣碎、匀浆，得到鸡肉匀浆样品；
15、(7)酶法水解：称取鸡肉匀浆样品，加入占鸡肉匀浆样品的质量百分数为6-10％的菠萝蛋白酶以及加入磷酸盐缓冲液，漩涡混匀，水浴振荡处理，得到酶解液；
16、(8)提取：调节步骤(2)所得酶解液的ph，用na2edta-mcllvaine缓冲液超声提取一次以上，离心合并上清液，过滤，待净化；
17、(9)净化：通过亲水亲油固相萃取聚合小柱(hlb柱)对步骤(3)中获得的滤液进行富集和净化，得到洗脱液；将洗脱液吹至近干、重新溶解残渣、膜过滤后装入进样小瓶；
18、(10)定量：采用hplc-ms/ms测定样品中四环素类抗生素残留含量。
19、在一种实施方式中，所述方法还包括建立四环素类抗生素浓度与hplc-ms/ms测得特征离子峰面积的标准曲线；将待测样品使用hplc-ms/ms测得的特征离子峰面积，代入标准曲线，即获得待测样品中四环素类抗生素残留含量。
20、在一种实施方式中，所述建立四环素类抗生素浓度与hplc-ms/ms测得特征离子峰面积的标准曲线，包括：(a)基质匹配系列混合标准溶液制备；(b)将得到的基质匹配系列混合标准溶液提交至液相色谱-串联质谱仪测定，以测得特征离子峰面积为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。
21、在一种实施方式中，所述基质匹配系列混合标准溶液制备具体是：精密量取混合标准工作液适量，分别加入6份经提取和净化的空白试样残渣中，氮吹至近干，并用1ml含5％甲醇的三氟乙酸水溶液(10mmol/l)重新溶解残渣，经0.45μm滤膜，配制成浓度为1μg/kg、2μg/kg、10μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、和250μg/kg的基质匹配系列混合标准溶液。
22、在一种实施方式中，所述方法包括：
23、(1)样品处理：将新鲜的鸡肉样品用组织粉碎机彻底捣碎，装入清洁的密封袋中，放置于-18℃冰箱中备用；
【技术保护点】
1.一种污染鸡肉样品中四环素类抗生素的萃取方法，其特征在于，所述方法包括先对鸡肉进行酶解得到酶解液，再从酶解液中萃取；其中，所述酶解液的制备包括：将新鲜的鸡肉样品捣碎、匀浆，得到鸡肉匀浆样品，然后加入占鸡肉匀浆样品的质量百分数为6-10％的菠萝蛋白酶、磷酸盐缓冲液，漩涡混匀，水浴振荡处理，得到酶解液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：调节所得酶解液的pH，用Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液超声提取一次以上，离心合并上清液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菠萝蛋白酶的添加量为鸡肉样品质量的8-10％；可选地为8％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水浴振荡是在30-45℃下水浴摇床上振荡3-5h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超声提取是提取3次，每次旋涡混合1min，然后在冰水浴中超声提取10min；在3000r/min离心5min后，收集并合并三次萃取的上清液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述调节所得酶解液的pH是调节pH
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的四环素类抗生素包括四环素、土霉素和金霉素。
8.一种测定污染鸡肉中四环素类抗生素残留的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括建立四环素类抗生素浓度与HPLC-MS/MS测得特征离子峰面积的标准曲线；将待测样品使用HPLC-MS/MS测得的特征离子峰面积，代入标准曲线，即获得待测样品中四环素类抗生素残留含量。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：
...【技术特征摘要】
1.一种污染鸡肉样品中四环素类抗生素的萃取方法，其特征在于，所述方法包括先对鸡肉进行酶解得到酶解液，再从酶解液中萃取；其中，所述酶解液的制备包括：将新鲜的鸡肉样品捣碎、匀浆，得到鸡肉匀浆样品，然后加入占鸡肉匀浆样品的质量百分数为6-10％的菠萝蛋白酶、磷酸盐缓冲液，漩涡混匀，水浴振荡处理，得到酶解液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：调节所得酶解液的ph，用na2edta-mcllvaine缓冲液超声提取一次以上，离心合并上清液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菠萝蛋白酶的添加量为鸡肉样品质量的8-10％；可选地为8％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水浴振荡是在30-45℃下水浴摇床上振荡3-5h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚卫蓉，文阿瑛，陈宇伦，袁少锋，于航，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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