【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于兽医学领域，涉及一种基于raa与crispr技术的犬、猫细小病毒试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、犬、猫细小病毒(cpv与fpv)为无囊膜的单链dna病毒，病毒粒子呈圆形或六边形，基因组长度约为5200nt，包含两个编码结构蛋白的开放阅读框(vp1和vp2)和非结构蛋白(ns1和ns2)。vp2蛋白由vp2基因翻译产生，是病毒衣壳的主要成分，其高度保守，并且是cpv的主要免疫保护性抗原。不同细小病毒的vp2蛋白在宿主细胞特异性和单克隆抗体识别方面存在较大差异，因此常被选为基因工程的靶基因，并用于病毒鉴定。
2、传统的犬、猫细小病毒实验室诊断方法主要依靠病原学、免疫学和分子生物学方法，病毒分离培养是高度特异性的诊断方法，但费时、费力、昂贵，且需要专业技术人员，这限制了其应用。基于分子生物学的检测方法包括pcr、实时定量pcr等，具有高度敏感性与特异性，但这些诊断方法有极大的限制，需要熟悉实验室操作的相关人员和相应的实验室设备，因此不适合在现场或基层实验室使用。而基于酶联免疫吸附试验(elisa)的检测方法是目前临床医生和从业人员从感染动物的粪便和血液中进行细小病毒检测的确证性诊断方法，其灵敏度高，但重复性较差，干扰因素较多，易发生交叉反应，从而出现假阳性。
3、核酸检测依旧是检测犬、猫细小病毒的金标准，如环介导等温扩增和重组酶聚合酶扩增等等温扩增技术，以及crispr检测技术等新型核酸检测技术被开发出来。重组酶介导等温核酸扩增技术(raa)是一种用于在细胞外合成dna或rna的技术。它在分子生
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于raa与crispr技术的犬、猫细小病毒试剂盒及检测方法，本专利技术基于重组酶介导等温核酸扩增技术(raa)检测技术具有操作简单、稳定并广泛应用于临床分子诊断的优势，将raa与crispr-cas12a结合，通过设计与筛选，最终提供一段靶向犬、猫细小病毒vp2基因，并激活crispr系统的crrna，构建能够特异性地检测犬、猫细小病毒的raa-crispr系统。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案包括：
3、第一方面，本专利技术提供一种用于检测犬、猫细小病毒的raa扩增引物对，所述raa扩增引物对包括如seq id no.1所示的核苷酸序列和如seq id no.2所示的核苷酸序列。
4、第二方面，本专利技术提供一种用于检测犬、猫细小病毒的试剂盒，包括所述的raa扩增引物对、cas12a蛋白和crrna；
5、所述crrna为：
6、uaauuucuacucuuguagauguagacaacauggucaaaaa。
7、进一步地，上述技术方案中，所述试剂盒还包括ssdna探针dna-fam：6-fam/ttatt/biotin。
8、第三方面，本专利技术提供一种raa扩增引物对或者所述的试剂盒在检测犬、猫细小病毒中的应用。
9、进一步地，上述技术方案中，检测犬、猫细小病毒的方法包括如下步骤：
10、提取待测样本的细小病毒dna，使用所述raa引物对进行扩增；然后向体系中加入包含有cas12a蛋白、所述crrna和所述ssdna探针dna-fam的crispr/cas12的反应体系中进行cas12酶切反应，激活cas12a蛋白并与之结合，激活cas12a酶活性，然后切割相应的探针，滴加到测流层析试纸条后，被不同的配体捕获，显示测试结果。
11、进一步地，上述技术方案中，所述crispr/cas12的反应体系为：每50μl的反应体系包括1μl cas12a(1μm)、5μl ssdna探针dna-fam(10nm)、3μl pv-crrna(300nm)、5μl 10×neb 2.1buffer缓冲液、1μl rnase inhibitor(40u/μl)、10μl raa产物和25μl无酶水。
12、有益效果：
13、本专利技术基于crispr-cas12a核酸检测技术，通过设计与筛选，最终提供一段用于检测犬、猫细小病毒vp2基因的raa扩增引物对及能靶向扩增序列的特异性crrna，该crrna可通过激活cas12a实现对这种临床常见抗原核酸的高灵敏、高特异、高灵敏检测，适用于基层兽医站、宠物医院及临床快速检测，结果稳定可靠。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于检测犬、猫细小病毒的RAA扩增引物对，其特征在于，所述RAA扩增引物对包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测犬、猫细小病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的RAA扩增引物对、Cas12a蛋白和crRNA；
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ssDNA探针DNA-FAM：6-FAM/TTATT/Biotin。
4.一种RAA扩增引物对或者所述的试剂盒在检测犬、猫细小病毒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，检测犬、猫细小病毒的方法包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas12的反应体系为：每50μL的反应体系包括1μL Cas12a(1μM)、5μL ssDNA探针DNA-FAM(10nM)、3μL PV-crRNA(300nM)、5μL 10×NEB 2.1buffer缓冲液、1μL RNase inhibitor(40U/μl)、10μL RAA产物和
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测犬、猫细小病毒的raa扩增引物对，其特征在于，所述raa扩增引物对包括如seq id no.1所示的核苷酸序列和如seq id no.2所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测犬、猫细小病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的raa扩增引物对、cas12a蛋白和crrna；
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ssdna探针dna-fam：6-fam/ttatt/biotin。
4.一种raa扩增引物对或者所述的试剂盒在检测...
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