【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株基于马立克病病毒特超强变异株的meq基因编辑缺失的md疫苗候选毒株sq01δmeq及构建和应用，属于动物病毒学领域。
技术介绍
1、马立克病(md)是因早期感染鸡马立克病病毒(mdv)而诱发的一种最重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病，每年给全球养禽业造成巨大经济损失。与md有关的家禽疱疹病毒包括三种不同血清型，分别为血清ⅰ型(mdv-1)即禽疱疹病毒2型(gaahv-2)、血清ⅱ型(mdv-2)即禽疱疹病毒3型(gaahv-3)和血清ⅲ型(mdv-3)即火鸡疱疹病毒(hvt)/(meahv-1)。其中只有mdv-1分离株具有致病和致瘤性。作为首个成功应用疫苗控制的病毒性肿瘤病，md曾在上世纪末的数十年中得到良好控制。但md疫苗的长期使用及超强的免疫压力，导致mdv流行毒株持续进化及毒力不断增强。近年来，一些特超强mdv(vv+mdv)毒株，特别是最近从md疫苗免疫鸡群发病病例中分离鉴定的特超强毒mdv(hv-mdv)变异株，被证实已全面突破了当前广泛使用的md经典疫苗的免疫保护，很可能是导致近期全球养禽业频繁爆发md疫情的主要原因，给家禽养殖业造成严重危害。
2、meq基因是mdv的主要原瘤基因，全长1020bp，是mdv-1特有的基因。有研究表明，meq基因与其他转录因子通过宿主和病毒基因的表达修饰在mdv诱导的t细胞淋巴瘤发生中发挥关键作用。有学者在利用细菌人工染色体(bac)和基因同源重组技术，敲除mdv强毒株的meq基因后发现病毒不再具有致瘤作用，这一发现揭示了meq基因在mdv致瘤中发挥关键作用
3、鉴于疫苗免疫鸡群频繁爆发md病例，当前广泛使用的经典md疫苗对新出现的hv-mdv中国变异株的免疫保护效力低下，迫切需要开发新的更高效的md疫苗以应对md防控的新挑战。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一株基于马立克病病毒特超强中国变异株的meq基因编辑缺失的md疫苗候选毒株sq01δmeq及构建和应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一株马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株sq01δmeq，所述马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株为sq01δmeq，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45864。
4、所述疫苗候选毒株sq01δmeq的亲本毒株为分离自中国鸡群流行的马立克病病毒特超强变异株hnsq01，该亲本毒株的全基因组的核苷酸序列全长为176043bp，如seq idno.1所示。
5、所述疫苗候选毒株sq01δmeq是以马立克病病毒特超强中国变异株hnsq01为亲本毒株，将其基因组中的两个meq等位基因分别编辑缺失一个长度同为925bp的片段，基因缺失的分子标记位点分别为：第4486～5411位和133584～134509位。
6、所述马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株sq01δmeq的构建方法，利用crispr/cas9基因编辑技术，敲除两个meq等位基因构建而成。
7、所述马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株sq01δmeq在鸡马立克病新型疫苗制备中的应用。
8、所述鸡马立克病新型疫苗是以sq01δmeq为疫苗毒株构建的鸡马立克病基因工程疫苗、鸡马立克病多联疫苗或鸡马立克病多价疫苗；或者以sq01δmeq为亲本毒株构建的鸡马立克病基因工程疫苗、鸡马立克病多联疫苗或鸡马立克病多价疫苗。
9、所述鸡马立克病基因工程疫苗为基因缺失疫苗、基因重组疫苗或病毒载体疫苗。
10、所述应用包括但不仅限于利用所述马立克病病毒meq基因缺失疫苗候选毒株sq01δmeq的病毒粒子、病毒核酸dna或全基因组序列信息。
11、本专利技术有益效果：
12、1、本专利技术的马立克病病毒hnsq01的meq基因缺失毒株sq01δmeq，是以国内最新分离的hv-mdv变异株为亲本毒株，利用crispr/cas9基因编辑技术构建的meq基因编辑缺失的md疫苗候选毒株。通过meq基因编辑缺失毒株的构建及鉴定、1日龄spf鸡攻毒致病性分析以及作为候选疫苗的动物免疫攻毒保护评价等一系列实验研究，证实sq01δmeq可以作为一株新型高效md基因工程疫苗候选毒株，能提供最全面可靠的实验依据。本专利技术针对当前国内鸡群流行的mdv优势毒株尤其是hv-mdv变异株，研制了新型的基因缺失疫苗毒株，可提供良好的免疫保护效率，填补了我国新一代md高效疫苗研发的空白。
13、2、本专利技术提供的马立克病病毒meq基因缺失疫苗候选毒株sq01δmeq的亲本毒株为hnsq01，并通过病毒全基因组测序、1日龄spf鸡攻毒实验以及md疫苗免疫保护攻毒实验等一系列的mdv致病性分析及致病型鉴定实验，该毒株可以很好的代表当前国内鸡群流行的mdv优势毒株，该毒株来源及遗传背景清晰。
14、3、本专利技术的马立克病病毒meq基因缺失毒株sq01δmeq，通过pcr鉴定、基因克隆测序、rt-qpcr分析、ifa鉴定及spf鸡攻毒实验，确保sq01δmeq毒株完全丧失了对宿主鸡的致病性和致瘤性，且无免疫抑制性，生物安全性良好。免疫攻毒保护实验结果显示，sq01δmeq具有良好的免疫保护性，对亲本毒株hnsq01的免疫保护指数(pi)达到80.0％。因此，本专利技术的sq01δmeq毒株不仅可作为最新md基因缺失疫苗候选毒株，还可用于后续md新型基因工程疫苗的开发和利用。
15、4、本专利技术提供的马立克病病毒meq基因缺失疫苗候选毒株sq01δmeq的病毒粒子和病毒核酸dna，可以在其基础上继续利用crispr/cas9等基因编辑技术，构建更多的马立克病基因工程疫苗，如基因缺失、基因重组或病毒载体疫苗等，可为新一代md高效疫苗的创制奠定重要基础，同时也可为其他家禽病毒的基因工程重组疫苗提供载体。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一株马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株SQ01Δmeq，其特征在于，所述马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株为SQ01Δmeq，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.45864。
2.如权利要求1所述的马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株SQ01Δmeq，其特征在于，所述疫苗候选毒株SQ01Δmeq的亲本毒株为分离自中国鸡群流行的马立克病病毒特超强变异株HNSQ01，该亲本毒株的全基因组的核苷酸序列全长为176043bp，如SEQ IDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株SQ01Δmeq，其特征在于，所述疫苗候选毒株SQ01Δmeq是以马立克病病毒特超强变异株HNSQ01为亲本毒株，将其基因组中的两个meq等位基因分别编辑缺失一个长度同为925bp的片段，基因缺失的分子标记位点分别为：第4486～5411位和133584～134509位。
4.一种权利要求3所述的马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株SQ01Δmeq的构建方法，其特
5.一种权利要求1所述的马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株SQ01Δmeq在鸡马立克病新型疫苗制备中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述鸡马立克病新型疫苗是以SQ01Δmeq为疫苗毒株构建的鸡马立克病基因工程疫苗、鸡马立克病多联疫苗或鸡马立克病多价疫苗；或者以SQ01Δmeq为亲本毒株构建的鸡马立克病基因工程疫苗、鸡马立克病多联疫苗或鸡马立克病多价疫苗。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述鸡马立克病基因工程疫苗为基因缺失疫苗、基因重组疫苗或病毒载体疫苗。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括但不仅限于利用所述马立克病病毒meq基因缺失疫苗候选毒株SQ01Δmeq的病毒粒子、病毒核酸DNA或全基因组序列信息。
...【技术特征摘要】
1.一株马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株sq01δmeq，其特征在于，所述马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株为sq01δmeq，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.45864。
2.如权利要求1所述的马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株sq01δmeq，其特征在于，所述疫苗候选毒株sq01δmeq的亲本毒株为分离自中国鸡群流行的马立克病病毒特超强变异株hnsq01，该亲本毒株的全基因组的核苷酸序列全长为176043bp，如seq idno.1所示。
3.如权利要求1所述的马立克病病毒meq基因编辑缺失疫苗候选毒株sq01δmeq，其特征在于，所述疫苗候选毒株sq01δmeq是以马立克病病毒特超强变异株hnsq01为亲本毒株，将其基因组中的两个meq等位基因分别编辑缺失一个长度同为925bp的片段，基因缺失的分子标记位点分别为：第4486～5411位和133584～134509位。
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊，滕蔓，张多，郑鹿平，罗琴，贾斌，邢广旭，柴书军，赵东，程娜，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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