【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光学显微成像技术，一种三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统及方法。
技术介绍
1、细胞作为有机体构成和生命活动的基本单位，其内部三维结构的重现对生物医学和生命科学界的研究起着至关重要的作用。然而，由于大部分生物细胞在可见光波段的弱吸收性(表现为无色透明)，使得通过传统的明场光学显微镜技术难以获得清晰的细胞成像。
2、针对上述问题，荧光显微镜技术通过利用外源性荧光染料进行成像，实现了对可被荧光标记的细胞的高分辨率三维成像。该技术通过选择性地标记细胞内的特性分子，从而针对性地显示细胞的结构和功能特性。然而，荧光显微技术受限于光毒性、光漂白以及被标记细胞的性质等因素，仍存在局限性。无标记成像技术利用细胞内细胞器各组分折射率分布的不均匀性，会对入射光引入相位延迟的特点，允许对透明活细胞的动态生命过程以及各项生理活动进行研究分析，无需任何预先处理，使得折射率成为一种理想的内源性“物理染料”。在无标记成像的三维成像领域，以数字全息显微术为代表的干涉方法依赖高度相干光源和复杂的旋转扫描装置，易受散斑噪声影响，成像速度受限。非干涉代表方法之一的傅里叶叠层衍射层析成像技术，是一种利用傅里叶叠层概念的三维衍射层析成像方法。该方法可兼容传统明场显微成像光路，无需任何干涉装置和机械扫描装置，成本低廉；但与傅里叶叠层成像技术类似，其重构算法较为复杂，迭代计算速度缓慢，不适用于高速实时成像。属于非干涉方法另一分支的光强衍射层析技术与光强传输衍射层析技术直接利用所拍摄物体不同焦面的强度图像反演出物体的三维折射率分布，实现了光强传输方
3、现行的光强传输衍射层析技术通常采用机械装置在z轴上对样本进行扫描，存在位移驱动的惯性延迟，极大限制了成像的时间分辨率。无标记成像单一的成像模态能够对细胞的整体形态进行表征，但在特异性成像方面并不理想。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的方法与系统，可同时获取样本的整体形态信息及特异性信息，实现对样本的快速三维成像。
2、实现本专利技术目的的技术解决方案为：一种三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统，包括可编程led照明组件，倒置显微成像系统以及4f系统，所述倒置显微成像系统包括显微物镜、汞灯、二向色镜、反光镜与镜筒透镜，其中物镜、反光镜与位于透射方向的二向色镜按顺序从上至下纵向安装，汞灯置于二向色镜水平反射方向，镜筒透镜置于反光镜水平反射方向，所述4f系统包括同光轴依次设置的第一透镜l1、电控变焦透镜、第二透镜l2以及scmos相机，在无标记成像模态下，可编程led照明组件的照明光照射到待测样品上，透过待测样品的光被显微物镜接收，透过二向色镜后经过反光镜反射，通过镜筒透镜放大成像在4f系统的物面；在荧光成像模态下，汞灯发出满足激发要求波长的光，经二向色镜反射照射到待测样品上，激发样品产生荧光，发射光透过二向色镜后经过反光镜反射，经过镜筒透镜放大成像在4f系统的物面。
3、优选地，所述电控变焦透镜利用可编程电流源电流控制电流驱动电控变焦透镜，并产生触发脉冲使电控变焦透镜与scmos相机同步。
4、本专利技术还提出了一种三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的方法，具体步骤为：
5、第一步：在无标记成像模态下，通过可编程led照明组件设定不同照明孔径；
6、第二步：采用可编程电流源编程控制变焦透镜焦距连续变化，从而对倒置显微系统像面进行相位调制，scmos相机同步采集在多个照明孔径下的多张不同离焦量下的部分离焦图像；
7、第三步：在荧光成像模态下，使用汞灯对样本荧光进行激发；
8、第四步：采用可编程电流源编程控制变焦透镜焦距连续变化，从而对倒置显微系统像面进行相位调制，scmos相机同步采集在多种激发波长下的多张不同离焦量下的部分离焦图像；
9、第五步：对无标记成像模态下采集的数据进行处理，得到无标记方法解算的样本三维复折射率分布结果；
10、第六步：对荧光成像模态下采集的数据进行处理，得到荧光成像方法解算的样本三维荧光成像结果；
11、第七步：对样本的三维复折射率分布结果与三维荧光成像结果根据空间位置进行对准，实现多种成像模态的三维同步呈现。
12、优选地，第一步中使用两种不同的照明孔径，分别为直径与物镜数值孔径相匹配的圆形照明孔径，以及外径与物镜数值孔径相匹配的环形照明孔径。
13、优选地，第五步对无标记成像模态下采集的数据进行处理，得到无标记方法解算的样本三维复折射率分布结果的具体方法为：
14、确定特定照明模式下的三维吸收传递函数ha和相位传递函数hp，具体为：
15、
16、
17、其中，s为照明孔径的光源函数，λ为照明光波长，μ为横向空间频率坐标，η为纵向空间频率坐标，p为圆形物镜的孔径函数，μ'为频域空间的积分变量，δ为狄拉克函数；
18、构建三维物体散射势谱与光强关系，具体为：
19、
20、其中，bt为不同堆栈下采集图像的背景强度，与代表样本散射势相位与吸收部分的傅里叶变换，ha,t为不同照明孔径下的吸收传递函数，hp,t为不同照明孔径下的相位传递函数，t表示照明孔径。
21、将三维物体散射势谱与光强关系转变为线性方程组的求解，目标函数表示为：
22、
23、其中，表示两组实际测量堆栈的傅里叶变换，hp,t,ha,t为与之对应的三维相位传递函数与吸收传递函数，表示基于当前估计和正向模型的频谱预测测量值，t表示照明孔径，α和β为与和对应的正则化参数；
24、分别令目标函数中与的导数为零，得
25、
26、
27、其中，表示二维傅里叶逆变换运算，a为归一化项，具体表示为：
28、
29、根据样本散射势与复折射率分布关系，确定样本三维复折射率，关系式具体为：
30、f(r)＝k02[n02-n2(r)]
31、其中，r表示空间三维坐标，f(r)＝fre+ifim为样本散射势，n(r)＝nre+inim为样本复折射率，k0＝2π/λ为波矢，λ为自由空间中光的波长，n0为样本周围介质折射率。
32、本专利技术与现有技术相比，其显著优点：(1)本系统能够在单一仪器上实现无标记相位成像与荧光成像，支持模式间的自由切换及多模态同时成像。允许长时间连续成像，避免了荧光激发可能引起的光毒性和光漂白问题；(2)通过led照明角度扫描技术，无需干涉即可实现样品的三维折射率成像，为生物医学研究提供了更高维度的信息；(3)采用低相干性照明光源，避免了高相干性激光带来的散斑噪声，相较于干涉方法在成像质量上实现了显著提升；(4)电控变焦透镜的使用，使得系统在轴向扫描上不依赖机械装置的位移，在系统成像速本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统，其特征在于，包括可编程LED照明组件，倒置显微成像系统以及4f系统，所述倒置显微成像系统包括显微物镜、汞灯、二向色镜、反光镜与镜筒透镜，其中物镜、反光镜与位于透射方向的二向色镜按顺序从上至下纵向安装，汞灯置于二向色镜水平反射方向，镜筒透镜置于反光镜水平反射方向，所述4f系统包括同光轴依次设置的第一透镜L1、电控变焦透镜、第二透镜L2以及sCMOS相机，在无标记成像模态下，可编程LED照明组件的照明光照射到待测样品上，透过待测样品的光被显微物镜接收，透过二向色镜后经过反光镜反射，通过镜筒透镜放大成像在4f系统的物面；在荧光成像模态下，汞灯发出满足激发要求波长的光，经二向色镜反射照射到待测样品上，激发样品产生荧光，发射光透过二向色镜后经过反光镜反射，经过镜筒透镜放大成像在4f系统的物面。
2.根据权利要求1所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统，其特征在于，所述电控变焦透镜利用可编程电流源电流控制电流驱动电控变焦透镜，并产生触发脉冲使电控变焦透与sCMOS相机同步。
3.根据权利要求1所述的三维荧光辅助吸收和折
4.根据权利要求1所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统，其特征在于，所述第一透镜L1焦距为f1，第二透镜L2焦距为f2，f1＝f2，电控变焦透镜置于两者之间，距离第一透镜L1为f1，距离第二透镜L2为f2，倒置显微系统像面距离第一透镜L1大小为f1，第二透镜L2距离sCMOS相机成像面端口的距离为f2。
5.一种三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的方法，其特征在于，具体步骤为：
6.根据权利要求5所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的方法，其特征在于，第一步中使用两种不同的照明孔径，分别为直径与物镜数值孔径相匹配的圆形照明孔径，以及外径与物镜数值孔径相匹配的环形照明孔径。
7.根据权利要求5所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的方法，其特征在于，第五步对无标记成像模态下采集的数据进行处理，得到无标记方法解算的样本三维复折射率分布结果的具体方法为：
8.根据权利要求5所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的方法，其特征在于，圆形物镜的孔径函数具体为：
9.根据权利要求5所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的方法，其特征在于，第六步对荧光成像模态下采集的数据进行处理，得到荧光成像方法解算的三维荧光成像结果的具体方法为：
...【技术特征摘要】
1.一种三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统，其特征在于，包括可编程led照明组件，倒置显微成像系统以及4f系统，所述倒置显微成像系统包括显微物镜、汞灯、二向色镜、反光镜与镜筒透镜，其中物镜、反光镜与位于透射方向的二向色镜按顺序从上至下纵向安装，汞灯置于二向色镜水平反射方向，镜筒透镜置于反光镜水平反射方向，所述4f系统包括同光轴依次设置的第一透镜l1、电控变焦透镜、第二透镜l2以及scmos相机，在无标记成像模态下，可编程led照明组件的照明光照射到待测样品上，透过待测样品的光被显微物镜接收，透过二向色镜后经过反光镜反射，通过镜筒透镜放大成像在4f系统的物面；在荧光成像模态下，汞灯发出满足激发要求波长的光，经二向色镜反射照射到待测样品上，激发样品产生荧光，发射光透过二向色镜后经过反光镜反射，经过镜筒透镜放大成像在4f系统的物面。
2.根据权利要求1所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统，其特征在于，所述电控变焦透镜利用可编程电流源电流控制电流驱动电控变焦透镜，并产生触发脉冲使电控变焦透与scmos相机同步。
3.根据权利要求1所述的三维荧光辅助吸收和折射率解耦合的系统，其特征在于，所述可编程led照明组件包含led照明阵列及其控制单元，通过控制单元按照设定对样本提供不同照明...
【专利技术属性】
技术研发人员：左超，周子豪，张润南，周宁，吴洪军，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：
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