【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉生物医药，具体涉及一种腺相关病毒突变体及其应用。
技术介绍
1、腺相关病毒(aav)是长约4.7kb单链dna片段组成的非致病缺陷病毒。aav基因组包含于非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框和末端反向重复序列。重组腺相关病毒载体(raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，作为一种重要的基因载体，由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，被广泛应用于基因功能研究和基因治疗领域。不同的血清型对组织和细胞有着不同的特异亲嗜性，转染效率有所差别。
2、肿瘤免疫疗法通过激活自身免疫系统或增强机体抗肿瘤免疫应答的方式，特异性识别并清除肿瘤细胞。因其副作用小、起效快，成为当前肿瘤治疗领域发展方向。随着近几年对肿瘤免疫疗法的深入研究，多种类型的疗法在难治复发肿瘤中出现很好的疗效，如抗体偶联药物、双靶向抗体、car-t疗法和tcr-t疗法等。在抑制肿瘤生长、清除肿瘤病灶方面，t细胞具有重要作用。免疫检查点抑制剂和肿瘤浸润淋巴细胞的相关研究表明了t细胞治疗癌症的潜力。但t细胞于治疗方面所发挥的效果受肿瘤特异性、效应细胞数量所限制，并需克服任何局部免疫抑制因素。因此，研发一种对t细胞具有高效靶向性，且不会影响t细胞活性的病毒载体具有巨大的临床价值和商业意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种腺相关病毒突变体及其应用。
2、为实现上述目的，本专利技术采取的技术
3、第一方面，本专利技术提供一种aav6衣壳蛋白突变体，包括异源肽；所述异源肽的氨基酸序列如seq id no.1～seq id no.11任一序列所示；所述异源肽的插入位点位于aav衣壳蛋白氨基酸588和589之间。
4、本专利技术的aav6衣壳蛋白突变体无需整合基因组，所构建得到的重组腺相关病毒特异性地感染激活的t细胞，可实现快速感染和回输，减少不必要的质检和体外停留时间。
5、作为本专利技术所述的aav6衣壳蛋白突变体的优选实施方式，其氨基酸序列如seq idno.23～seq id no.33任一序列所示。
6、第二方面，本专利技术提供一种编码aav6衣壳蛋白突变体的核酸，包括异源肽；所述异源肽的核苷酸序列如seq id no.12～seq id no.22任一序列所示。
7、作为本专利技术所述的核酸的优选实施方式，其核苷酸序列如seq id no.34～seq idno.44任一序列所示。
8、第三方面，本专利技术提供一种重组腺相关病毒，包括所述的aav6衣壳蛋白突变体。该腺相关病毒突变体对静息t细胞特异性的感染能力，具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。未激活的t细胞感染可以实现当天收集细胞当天感染，当天回输的优点，极大降低了制备成本，可减少对t细胞活性的影响。
9、作为本专利技术所述的重组腺相关病毒的优选实施方式，还包括异源目的基因；所述异源目的基因编码干扰rna、适配体、内切核酸酶、指导rna中任一种基因产物。
10、第四方面，本专利技术将所述的aav6衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞的药物或制备肿瘤免疫治疗药物中应用。
11、优选的，所述细胞为免疫细胞。
12、优选的，所述免疫治疗包括car-t疗法或tcr-t疗法。
13、第五方面，本专利技术将所述的aav6衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在感染静息t细胞中应用。
14、第六方面，本专利技术提供一种高产aav6衣壳蛋白突变体病毒库的制备方法，包括以下步骤：
15、(1)构建aav6骨架载体；所述aav6骨架载体包含cag启动子、intron、突变的aav6cap序列和polya；所述突变的aav6 cap序列包括去除aav6cap序列的t589后序列和n583的t与polya前段的序列构成后续用于酶切骨架的位点；
16、(2)构建aav2突变rep-cap载体；所述aav2突变rep-cap载体中cap序列的vp1、vp2、vp3起始密码的前20bp内引入终止密码子；
17、(3)以包含aav6 cap的载体为模板，利用引物pcr扩增获得包含随机序列的核酸片段；将所述核酸片段通过gibson同源重组连接的方式连接入所述aav6库骨架载体；得aav6随机肽载体库；
18、(4)将所述aav2突变rep-cap质粒、所述aav6随机肽载体库、phelper质粒共转于细胞中，纯化腺相关病毒，即得高产aav6衣壳蛋白突变体病毒库。
19、本专利技术在制备aav6突变体病毒库时，使用基于aav2的rep-cap失活突变载体，而非基于aav6的rep-cap失活突变载体进行病毒包装。定量结果显示，使用基于aav2的rep-cap失活突变载体包装aav6病毒库时，产量达到超10倍提升，并且具有各突变体丰度高、均一度好的优点。测序结果未发现采用基于aav2的rep-cap失活突变载体制备的aav6病毒库中存在aav6和aav2的cap重组序列。
20、作为本专利技术所述的制备方法的优选实施方式，所述引物为：
21、gggactgtggcagtcaatctccagagcagcagcnnknnknnknnknnknnknnkacagaccctgcgaccggagat和/或
22、cggtttattgattaacaatcgattacaggggacgggtgaggtaac。
23、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
24、本专利技术筛选所得的aav衣壳蛋白突变体构建得到的重组腺相关病毒载体靶向t细胞的效率高，具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。本专利技术筛选所得的aav衣壳蛋白突变体无需整合基因组，所构建得到的重组腺相关病毒感染静息的t细胞可实现快速感染和回输，减少不必要的质检和体外停留时间，使用本专利技术筛选所得的aav衣壳蛋白突变体感染静息t细胞具有巨大的临床价值和商业应用场景。
25、本专利技术在制备aav6突变体病毒库时，使用基于aav2的rep-cap失活突变载体，而非基于aav6的rep-cap失活突变载体进行病毒包装。定量结果显示，使用基于aav2的rep-cap失活突变载体包装aav6病毒库时，产量达到超10倍提升，并且具有各突变体丰度高、均一度好的优点。测序结果未发现采用基于aav2的rep-cap失活突变载体制备的aav6病毒库中存在aav6和aav2的cap重组序列。
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1.一种AAV6衣壳蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.30所示。
2.一种编码AAV6衣壳蛋白突变体的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.41所示。
3.一种重组腺相关病毒，其特征在于，包括权利要求1所述的AAV6衣壳蛋白突变体。
4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒，其特征在于，还包括异源目的基因；所述异源目的基因编码干扰RNA、适配体、内切核酸酶、指导RNA中任一种基因产物。
5.权利要求1所述的AAV6衣壳蛋白突变体、权利要求3或4所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞的药物或制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细胞为免疫细胞；所述免疫治疗包括CAR-T。
7.权利要求1所述的AAV6衣壳蛋白突变体、权利要求3或4所述的重组腺相关病毒在感染静息T细胞中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种aav6衣壳蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.30所示。
2.一种编码aav6衣壳蛋白突变体的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.41所示。
3.一种重组腺相关病毒，其特征在于，包括权利要求1所述的aav6衣壳蛋白突变体。
4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒，其特征在于，还包括异源目的基因；所述异源目的基因编码干扰rna、适配体、内切...
【专利技术属性】
技术研发人员：李华鹏，樊颖，钟育健，卜晔，檀克勤，张有为，代志勇，
申请(专利权)人：广州派真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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