【技术实现步骤摘要】
本公开属于核酸疫苗，具体涉及一种呼吸道合胞病毒mrna疫苗及其制备方法和应用。
技术介绍
1、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，rsv）是一种副黏病毒科肺炎病毒属的负单链rna病毒。1956年科学家从黑猩猩呼吸道标本分离出rsv病毒，因其在细胞培养过程中导致相邻细胞融合，细胞变形成类似合胞体的结构而被称为呼吸道合胞病毒。
2、rsv病毒是引起婴幼儿、老年人及免疫功能缺陷患者下呼吸道感染的重要病原体。rsv由空气传播，通过口鼻吸入进入气管和肺部，侵入上皮细胞导致气道损伤，气道表面分泌呼吸道粘液阻塞管腔，引起呼吸困难。rsv感染的常见症状是流涕、发热、咳嗽和哮喘，病情严重后会引发呼吸窘迫甚至造成气道堵塞，从而引起呼吸衰竭甚至死亡。
3、rsv是一种常见的呼吸道病毒。一般会引起感冒样症状，rsv感染主要发生在秋季、冬季和春季，是导致5 岁以下婴幼儿和65 岁以上老年人感染严重呼吸道疾病的主因之一。对绝大多数青年人而言，rsv通常会引起轻微的、类似感冒的症状，但对婴幼儿和老年人而言，rsv感染则是一种可以致命的疾病。
4、rsv感染已成为世界性公共卫生问题。rsv是世界范围内引起5岁以下儿童急性下呼吸道感染（acute lower respiratory tract infections, alrti）最常见的病毒病原，是造成婴幼儿病毒性呼吸道感染住院的首要因素。有数据显示，rsv感染占所有alrti的28%，其中rsv住院死亡患儿占alrti导致死亡病例的13%
5、rsv感染呈全球性广泛流行特征，且流行受地理位置、温度和湿度等因素影响。例如我国北方地区rsv流行季开始于10月中旬至次年5月中旬，南方地区冬春季好发，与温度密切相关。rsv只有一个血清型，分为a、b两个亚型，我国北方呈交替流行趋势。
6、疫苗是预防rsv感染最经济、最有效的防治措施。who将rsv疫苗的研制列为急迫需要解决的问题之一。但是rsv疫苗的研制工作自上世纪60年代开展至今，一直没有监管机构认证的有效疫苗获批上市。最近rsv疫苗相继取得重大突破。2023年5月3日，gsk研发的呼吸道合胞病毒（rsv）疫苗arexvy获 fda 的上市批准，成为全球首款获批上市的 rsv 疫苗。该疫苗主要用于60岁及以上患者，预防 rsv 感染导致的下呼吸道（支气管及肺部）疾病。随后在2023年6月1日，美国fda又批准辉瑞的rsv蛋白疫苗abrysvotm上市，用于预防60岁及以上成人由rsv引起的急性呼吸道疾病和下呼吸道疾病。
7、目前在研的rsv疫苗技术路线有减毒活疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗、mrna疫苗等。传统疫苗通常基于灭活或减毒活病毒疫苗，或来源于病原体的亚单位蛋白。虽然这些疫苗产生有效的免疫反应，但它们有许多相关的安全问题。例如，早期开发的rsv灭活疫苗不但没有对接种者产生保护作用，反而出现了疾病增强作用（erd），即不但不能预防接种者感染rsv病毒，而且还会导致接种者感染rsv后病情加重。在一项rsv灭活疫苗临床试验中，试验组的20个婴儿中出现16个病情严重而且需要住院治疗, 住院率高达80%，其中还有两个婴儿死亡。
8、mrna疫苗是将编码病毒抗原的mrna导入体内并在机体内表达产生抗原，继而刺激体内产生免疫反应，因mrna仅存在于细胞质而不会整合到宿主基因组中且可以体内自然降解，因而安全性较高。mrna疫苗本身可以作为佐剂诱导机体产生天然免疫效应，而且mrna疫苗能诱导很强的体液免疫和细胞免疫，一般具有比传统灭活疫苗和亚单位蛋白疫苗更强的免疫效果。mrna疫苗不需要与其他疫苗佐剂联合使用，因此可减少由其他物质引起的不良反应。与传统疫苗相比，mrna疫苗生产工艺流程相对简单，研发周期短，对新发突发传染病疫苗研发具有快速响应的技术优势。mrna疫苗在新冠病毒疫苗研发中取得了成功，通过大规模人群接种证明了mrna疫苗技术的安全性和有效性。
9、rsv感染引起的中和抗体主要针对f蛋白。rsv f蛋白是一种ⅰ型融合糖蛋白，在rsv各型别之间相对保守，是理想的疫苗抗原靶蛋白。 f蛋白在两个构象之间转换：亚稳态的融合前构象（pre-f）和稳态的融合后构象(post-f)。尽管中和抗体靶向的抗原表位存在于f蛋白两种构象上，但人类对rsv感染的自然免疫应答特征表明，大多数rsv中和抗体表位位于f蛋白融合前构象。由于f蛋白融合前构象具有不稳定性，因此基于rsv灭活疫苗或直接从rsv中提取的f蛋白亚单位疫苗均以失败告终。
10、基于上述问题，为了进一步降低免疫力低下人群（包括儿童和老人等）罹患呼吸道合胞病毒的风险，亟待提供一种新型的预防rsv的 mrna疫苗，其具有良好的稳定性，并且接种疫苗后能显著提升体液免疫效果。
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种编码rsv f蛋白尤其是f蛋白融合前构象pre-f的mrna疫苗，rsva2亚型的野生蛋白序列示于seq id no：1（genbank id：138251），在此野生型基础上包含p102a、i379v和m447v共3个天然存在的突变（seq id no:210），该三个氨基酸残基突变后的序列在其它rsv a毒株中保守，综合考虑目前主流毒株f蛋白序列的差异，在其基础上设计候选突变抗原序列。
2、rsv病毒包括亚型a和b，其f蛋白的氨基酸序列约90%相同。对于a亚型的f0前体多肽的序列，例如a2毒株(genbank gi：138251；swiss prot p03420)，以及b亚型的f0前体多肽的序列，例如，18537毒株(genbank gi：138250；swiss prot p13843)，两者都是574个氨基酸的序列，并且二者的信号肽序列也已报道为氨基酸1-25 (genbank和uniprot)。在两个序列中，由于rsv病毒a型和b型二者的f蛋白序列的同源性高，因此本专利技术设计的rsv pre-fmrna及其制备的疫苗对rsv病毒a型和b型感染预防均有效。
3、如本文所述，使用pre-f的三维结构作为指导，工程改造并构建融合前f蛋白的稳定化形式 (“pre-f”抗原)，并且在动物模型中用于产生rsv中和免疫反应，所述免疫反应相比于abrysvotm基于rsv f蛋白的免疫原所实现的免疫反应具有显著提高，并且其在动物模型中提供针对rsv激发的保护。所述pre-f抗原可以用作rsv的潜在疫苗和用作诊断分子。
4、在一些实施方案中，所述重组rsv f蛋白包含一个或更多个氨基酸替换，所述氨基酸替换将所述蛋白稳定在融合前构象。例如，其将所述f蛋白的膜远端部分 (包含f1多肽的n端区域) 稳定在融合前构象。在特异性结合于一种或多种融合前构象抗体和/或呈现存在于rsv f蛋白的融合前而非融合后构象上的抗原位点如抗原位点φ的构象中。
5、在另一些实施方案中，所述重组rsv f蛋白可包含对f1多肽的c端的一种或更多种修本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种免疫原性组合物，包含呼吸道合胞病毒（RSV）的核糖核酸（RNA），所述RNA编码野生型RSV F蛋白或其变体；
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述RSV F蛋白变体包含选自以下的一种或更多种突变形式：序列截短、序列缺失和位点突变。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述序列截短包括缺少细胞质结构域。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其中，所述序列缺失选自以下一种或更多种：第104-136位氨基酸缺失和104-144位氨基酸缺失；任选地，所述序列缺失的氨基酸由GSGS短肽或GS短肽替代。
5.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述位点突变包括选自以下的一种或更多种：P102A、I379V和M447V。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的一种或更多种：S46G、S215P、L373R、S213P和N216P。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的任意一种或更多种：
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的任意一个
9.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下中的任意一个或更多个组合：
10.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的任意一个或更多个组合：
11.如权利要求5所述的组合物，其中所述RSV F蛋白变体包含P102A、I379V和M447V突变，所述RSV F蛋白变体为SEQ ID NO:1中第550-574位氨基酸被截掉后的截短蛋白，并且第104-144位氨基酸被替换为GS接头，同时所述RSV F蛋白变体还包含选自以下任意一组的位点突变组合：
12.如权利要求5所述的组合物，其中所述RSV F蛋白变体包含P102A、I379V和M447V突变，所述RSV F蛋白变体为SEQ ID NO:1中第550-574位氨基酸被截掉后的截短蛋白，并且第104-144位氨基酸被替换为GS接头，同时所述RSV F蛋白变体还包含选自以下任意一组位点突变组合：
13.如权利要求5所述的组合物，其中所述RSV F蛋白变体包含P102A、I379V和M447V突变，所述RSV F蛋白变体为SEQ ID NO:1中第550-574位氨基酸被截掉后的截短蛋白，并且第104-144位氨基酸被替换为GS接头，同时所述RSV F蛋白变体还包含选自以下任意一组的突变组合：
14.如权利要求5所述的组合物，其中所述RSV F蛋白的变体包含与SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 136、SEQID NO: 40、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO: 80的序列具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述RSV F蛋白的变体包含与SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 136、SEQID NO: 40、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 104或SEQ ID NO: 200的序列具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的组合物，其中，所述RSV F蛋白的变体包含与SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 176或SEQ ID NO: 116的序列具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求5所述的组合物，其中编码所述RSV F蛋白或其变体的开放阅读框（ORF）包含与SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 35或SEQ ID NO: 79具有至少80%、85%...
【技术特征摘要】
1.一种免疫原性组合物，包含呼吸道合胞病毒（rsv）的核糖核酸（rna），所述rna编码野生型rsv f蛋白或其变体；
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述rsv f蛋白变体包含选自以下的一种或更多种突变形式：序列截短、序列缺失和位点突变。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述序列截短包括缺少细胞质结构域。
4.如权利要求2或3所述的组合物，其中，所述序列缺失选自以下一种或更多种：第104-136位氨基酸缺失和104-144位氨基酸缺失；任选地，所述序列缺失的氨基酸由gsgs短肽或gs短肽替代。
5.如权利要求2或3所述的组合物，其中所述位点突变包括选自以下的一种或更多种：p102a、i379v和m447v。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的一种或更多种：s46g、s215p、l373r、s213p和n216p。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的任意一种或更多种：
8.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的任意一个或更多个组合：
9.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下中的任意一个或更多个组合：
10.如权利要求5所述的组合物，其中所述位点突变还包括选自以下的任意一个或更多个组合：
11.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv f蛋白变体包含p102a、i379v和m447v突变，所述rsv f蛋白变体为seq id no:1中第550-574位氨基酸被截掉后的截短蛋白，并且第104-144位氨基酸被替换为gs接头，同时所述rsv f蛋白变体还包含选自以下任意一组的位点突变组合：
12.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv f蛋白变体包含p102a、i379v和m447v突变，所述rsv f蛋白变体为seq id no:1中第550-574位氨基酸被截掉后的截短蛋白，并且第104-144位氨基酸被替换为gs接头，同时所述rsv f蛋白变体还包含选自以下任意一组位点突变组合：
13.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv f蛋白变体包含p102a、i379v和m447v突变，所述rsv f蛋白变体为seq id no:1中第550-574位氨基酸被截掉后的截短蛋白，并且第104-144位氨基酸被替换为gs接头，同时所述rsv f蛋白变体还包含选自以下任意一组的突变组合：
14.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv f蛋白的变体包含与seq id no: 204、seq id no: 12、seq id no: 208、seq id no: 176、seq id no: 116、seq id no: 136、seqid no: 40、seq id no: 52、seq id no: 4、seq id no: 104、seq id no: 200、seq id no:36或seq id no: 80的序列具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的氨基酸序列。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述rsv f蛋白的变体包含与seq id no: 204、seq id no: 12、seq id no: 208、seq id no: 176、seq id no: 116、seq id no: 136、seqid no: 40、seq id no: 52、seq id no: 4、seq id no: 104或seq id no: 200的序列具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的氨基酸序列。
16.如权利要求15所述的组合物，其中，所述rsv f蛋白的变体包含与seq id no: 204、seq id no: 12、seq id no: 208、seq id no: 176或seq id no: 116的序列具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的氨基酸序列。
17.如权利要求5所述的组合物，其中编码所述rsv f蛋白或其变体的开放阅读框（orf）包含与seq id no: 203、seq id no: 11、seq id no: 207、seq id no: 175、seq id no:115、seq id no: 135、seq id no: 39、seq id no: 51、seq id no: 3、seq id no: 103、seq id no: 199、seq id no: 35或seq id no: 79具有至少80%、85%、90％、95%或至少98%或100%同一性的核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述orf包含与seq id no: 203、seq id no:11、seq id no: 207、seq id no: 175、seq id no: 115、seq id no: 135、seq id no: 39、seq id no: 51、seq id no: 3、seq id no: 103或seq id no: 199具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的核苷酸序列。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述orf包含与seq id no: 203、seq id no:11、seq id no: 207、seq id no: 175或seq id no: 115具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%同一性的核苷酸序列。
20.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv的rna还包含5′非翻译区（utr）。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述5′非翻译区的序列为：seq id no:217、seqid no:218、seq id no:219、seq id no:220或seq id no:221。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述5′非翻译区的序列为seq id no:217。
23.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv的rna还包含3′非翻译区（utr）。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述3′非翻译区的序列为：seq id no:222、seqid no:223、seq id no:224或seq id no:225。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述3′非翻译区的序列为seq id no:222。
26.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv的rna还包含poly(a)尾。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述ploy(a)尾的长度为50~150个核苷酸。
28.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv的rna还包含5′端帽子结构。
29.如权利要求28所述的组合物，其中所述5′端帽子结构为：7mg(5′)ppp(5′)nlmpnp。
30.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv rna中编码所述rsv f蛋白或其变体的开放阅读框（orf）的序列是经过密码子优化的。
31.如权利要求30所述的组合物，其中所述orf的序列包含至少一种碱基修饰。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述碱基修饰包括选自以下的任意一种或更多种：假尿苷、n1-甲基假尿苷、n1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4′-硫尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫基-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮杂-尿苷、2-硫基-二氢假尿苷、2-硫基-二氢尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮杂-尿苷、二氢假尿苷、5-甲氧基尿苷和2′-o-甲基尿苷。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述碱基修饰包括将尿嘧啶以假尿苷和/或n1-甲基假尿苷替代。
34.如权利要求31所述的组合物，其中所述碱基修饰是1%~100%碱基修饰。
35. 如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv的rna的序列与seq id no: 205、seq idno: 13、seq id no: 209、seq id no: 177、seq id no: 117、seq id no: 137、seq id no:41、seq id no: 53、seq id no: 5、seq id no: 105、seq id no: 201、seq id no: 37或seq id no: 81具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%的同一性。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述rsv的rna的序列与seq id no: 205、seq idno: 13、seq id no: 209、seq id no: 177、seq id no: 117、seq id no: 137、seq id no:41、seq id no: 53、seq id no: 5、seq id no: 105或seq id no: 201具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%的同一性。
37. 如权利要求36所述的组合物，其中所述rsv的rna的序列与seq id no: 205、seqid no:13、seq id no:209、seq id no:177或seq id no:117具有至少80%、85%、90%、95%或至少98%或100%的同一性。
38.如权利要求5所述的组合物，其中所述rsv的rna为mrna。
39. 如权利要求5所述的组合物，其中编码所述rsv f蛋白或其变体的序列与seq idno:202、seq id no:10、seq id no:206、seq id no:174、seq id no:114、seq id no:134、seq id no:38、seq id no:50、seq id no:2、seq id no:102、seq id no: 198、seq id no:34或s...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋更申，董开，潘晨，汪王，周玉婷，柴欣，李静，朗晓威，张晋瑜，梁丽敏，王环宇，
申请(专利权)人：北京悦康科创医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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