【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种热稳定性乙酰胆碱酯酶突变体及其制备方法，属于生物工程。
技术介绍
1、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，简称为ache，ec 3.1.1.7)属于丝氨酸水解酶，是一种水解乙酰胆碱为胆碱和乙酸的酶。乙酰胆碱酯酶在神经突触间隙平衡乙酰胆碱水平并保证神经信号在生物体内的正常传递，在中枢神经系统和外周神经系统传导中发挥重要作用。当乙酰胆碱酯酶的活性区域与抑制剂结合，则无法分解乙酰胆碱，造成神经传导的紊乱。由于其重要的生理学作用，乙酰胆碱酯酶在生物防治、农药残留检测以及各类神经性疾病治疗方面有广泛的应用。
2、目前乙酰胆碱酯酶主要从家蝇头部、电鳗的器官中获取，存在提取纯化过程复杂、酶活性差、生产成本较高等问题，并且通过天然提取的方式获取的乙酰胆碱酯酶，敏感度低、稳定性差的问题。因此，利用基因工程技术实现乙酰胆碱酯酶的体外高效表达从而降低生产成本在实际应用需求中尤为重要。
3、随着应用领域的拓展，低热稳定性成为限制乙酰胆碱酯酶应用的主要障碍。在不同的温度条件下，乙酰胆碱酯酶可能表现出不同的活性和稳定性。目前，基于蛋白质结构的热点残基分析以及蛋白工程技术的改造，可以使其在特定条件下具有更高的活性和稳定性，从而提高工业生产过程的效率和成本效益。因此，我们期望通过蛋白质突变体的设计和筛选，为酶的高温稳定性提供重要的信息和指导，以期得到能够满足工业化需求的热稳定性乙酰胆碱酯酶。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有的乙
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的是提供一种热稳定性提高的乙酰胆碱酯酶突变体，所述突变体以尖音库蚊(culex pipiens)来源的乙酰胆碱酯酶为野生型酶，将其第340位氨基酸、第390位氨基酸和/或第581位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基。
4、在一种实施方式中，所述野生型酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
5、在一种实施方式中，所述突变体将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型酶的第340位丙氨酸替换为脯氨酸、第390位天冬氨酸替换为谷氨酸和/或第581位丝氨酸替换为脯氨酸。
6、具体的，所述乙酰胆碱酯酶突变体的氨基酸序列为如下序列中的任意一种：
7、(1)第340位丙氨酸突变为脯氨酸，以a340p表示；
8、(2)第390位天冬氨酸突变为谷氨酸，以d390e表示；
9、(3)第581位丝氨酸突变为脯氨酸，以s581p表示；
10、(4)第340位丙氨酸突变为脯氨酸，且第390位天冬氨酸突变为谷氨酸，以a340p/d390e表示；
11、(5)第340位丙氨酸突变为脯氨酸，且第581位丝氨酸突变为脯氨酸，以a340p/s581p表示；
12、(6)第390位天冬氨酸突变为谷氨酸，且第581位丝氨酸突变为脯氨酸，以d390e/s581p表示；
13、(7)第340位丙氨酸突变为脯氨酸、第390位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸和第581位氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸，以a340p/d390e/s581p表示。
14、在一种实施方式中，所述突变体的氨基酸序列如seq id no.2～5任一所示。
15、本专利技术还提供了编码所述乙酰胆碱酯酶突变体的核酸分子。
16、本专利技术还提供了包含所述核酸分子的表达载体。
17、本专利技术还提供了表达所述乙酰胆碱酯酶突变体或含有所述核酸分子或含有所述表达载体的宿主细胞。
18、在一种实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或病毒。
19、本专利技术还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达所述乙酰胆碱酯酶突变体。
20、本专利技术还提供了一种提高乙酰胆碱酯酶的热稳定性的方法，所述方法为以氨基酸序列如seq id no.1所示的乙酰胆碱酯酶为出发序列，将第340位丙氨酸替换为脯氨酸、第390位天冬氨酸替换为谷氨酸和/或第581位丝氨酸替换为脯氨酸。
21、本专利技术还提供了一种制备所述乙酰胆碱酯酶突变体的方法，所述方法为诱导培养所述重组大肠杆菌发酵制备乙酰胆碱酯酶。
22、本专利技术还提供了所述乙酰胆碱酯酶突变体或所述核酸分子或所述表达载体或所述宿主细胞或所述重组大肠杆菌在农药残留检测或在制备农药残留检测试剂盒中的应用。
23、有益效果：
24、本申请筛选到的上述突变体经过实验验证，最终证明了最优选的乙酰胆碱酯酶组合突变体的热稳定性显著提高。单突变体a340p、d390e、s581p的最适温度提高至40～50℃，半衰期也从野生型的48min延长至111.38～143.01min，且比酶活几乎不受影响。随后，本专利技术基于单突变体进行组合突变，其中，最优选突变体m4在40℃下半衰期t1/2是野生酶的4.2倍。与野生酶相比，最优突变体m4的最适温度从20℃提高到了50℃。其余突变体m1、m2和m3的最适温度也较野生型wt提高了10～30℃，并且，在乙酰甲胺磷抑制活性测定中，突变体m4表现出了比野生型wt更优异的敏感性，ic50达到0.029±0.0043mm。
25、本专利技术通过在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上突变得到的乙酰胆碱酯酶突变体，相比野生型乙酰胆碱酯酶表现出更好的热稳定性，在40℃以上的温度下活性更持久，在化工、食品等领域具有广阔的应用前景。
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1.一种热稳定性提高的乙酰胆碱酯酶突变体，其特征在于，所述突变体以尖音库蚊(Culexpipiens)来源的乙酰胆碱酯酶为野生型酶，将其第340位氨基酸、第390位氨基酸和/或第581位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型酶的第340位丙氨酸替换为脯氨酸、第390位天冬氨酸替换为谷氨酸和/或第581位丝氨酸替换为脯氨酸。
3.编码权利要求1或2所述乙酰胆碱酯酶突变体的核酸分子。
4.包含权利要求3所述核酸分子的表达载体。
5.表达权利要求1或2所述乙酰胆碱酯酶突变体或含有权利要求3所述核酸分子或含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞或病毒。
7.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达所述乙酰胆碱酯酶突变体。
8.一种提高乙酰胆碱酯酶的热稳定性的
9.一种制备所述乙酰胆碱酯酶突变体的方法，其特征在于，所述方法为诱导培养权利要求7所述重组大肠杆菌发酵制备乙酰胆碱酯酶。
10.权利要求1或2所述乙酰胆碱酯酶突变体、或权利要求3所述核酸分子、或权利要求4所述表达载体、或权利要求5或6所述宿主细胞、或权利要求7所述重组大肠杆菌在农药残留检测或在制备农药残留检测试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种热稳定性提高的乙酰胆碱酯酶突变体，其特征在于，所述突变体以尖音库蚊(culexpipiens)来源的乙酰胆碱酯酶为野生型酶，将其第340位氨基酸、第390位氨基酸和/或第581位氨基酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型酶的第340位丙氨酸替换为脯氨酸、第390位天冬氨酸替换为谷氨酸和/或第581位丝氨酸替换为脯氨酸。
3.编码权利要求1或2所述乙酰胆碱酯酶突变体的核酸分子。
4.包含权利要求3所述核酸分子的表达载体。
5.表达权利要求1或2所述乙酰胆碱酯酶突变体或含有权利要求3所述核酸分子或含有权利要求4所述表达载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其...
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