【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法。
技术介绍
1、外泌体是细胞释放到外部环境中的小囊泡，包含有反映其来源细胞状态和功能的蛋白质、脂质和rna。外泌体通过与周围细胞进行相互作用，扮演着重要的信号传递和调控功能，影响着细胞间的通讯和调节。这种作用方式使得外泌体成为了研究疾病机制、诊断疾病和开发治疗方法的重要领域。
2、血浆中的外泌体被认为是生物标志物分析的重要来源，尤其是神经细胞来源的外泌体，它们可能与多种神经系统疾病的发生和进展有关，在神经系统疾病的病理学和诊断研究中具有无限的应用前景：首先，神经细胞来源的外泌体在阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病中起着重要作用。通过研究这些外泌体中的分子组成，科学家可以更好地理解这些疾病的发病机制，并可能发现新的治疗靶点；其次，外泌体在神经损伤后的修复过程中扮演重要角色，它们可以促进神经再生和修复，帮助恢复神经功能，了解这一过程可以帮助开发治疗脊髓损伤和其他神经损伤的新方法；再次，神经细胞来源的外泌体可能包含特定于某些神经疾病的分子标志物。这为早期诊断和疾病进展监测提供了新的途径；此外，外泌体具有穿过血脑屏障的潜力，因此可以被用作针对大脑和中枢神经系统疾病的药物递送载体，这为治疗这些疾病提供了一种新的策略。
3、因此，富集和纯化神经细胞来源的外泌体具有重要的意义；然而，血浆中外泌体的低浓度和高度异质性使得外泌体的富集和纯化成为一个挑战。目前提取并纯化血浆中外泌体（extracellular vesicles，简称“evs”）
4、
5、具体来说，其中，常用于分离神经细胞来源的外泌体的方法是采用抗l1细胞黏附分子l1cam抗体偶联的生物素以及链霉亲和素偶联的树脂微球，与样本中的外泌体形成复合物，然后通过超速离心的方法去提取血浆中的外泌体。然而在研究应用中发现该方法具有不可避免的一些缺点，例如：l1细胞黏附分子l1cam在不同类型和发育阶段的神经细胞会有显著差异，受到调控的影响，使得检测的灵敏度有限，对于含有较低水平的l1cam的外泌体样本，放大信号会存在假阳性的现象，所以并不适用于l1cam低表达的神经细胞，如成熟的神经元、gabaergic等抑制性神经元等；此外，利用离心复合物沉淀的方式还会不可避免地造成外泌体的损伤。
6、基于以上现状，申请人希望提出技术方案来对解决以上技术问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，利用突触素蛋白抗体包被的琼脂糖磁性颗粒来有效富集和纯化血浆中神经细胞来源外泌体，为进一步的生物标志物分析和疾病诊断提供了重要的技术支持。
2、本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，至少包括以下步骤：
4、s1）、 将抗体包被的磁性颗粒与血浆混合，使得抗体包被的磁性颗粒中的抗体与血浆中神经细胞来源的外泌体进行特异性结合，其中，所述抗体为具有外泌体特异性识别功能的突触素蛋白syp抗体；
5、s2）、通过磁场作用分离所述磁性颗粒和与神经细胞来源的外泌体特异性结合的抗体，实现对血浆中神经细胞来源的外泌体的富集；
6、s3）、通过离心方式纯化上述步骤s2）所得到的富集的外泌体，用于去除非特异性结合的颗粒和/或其他血浆成分，得到纯化的神经细胞来源的外泌体。
7、优选地，所述抗体为单克隆抗体，优选为小鼠抗人突触素蛋白特异性的单克隆抗体。
8、优选地，所述磁性颗粒为琼脂糖磁性颗粒。
9、优选地，所述磁性颗粒的直径范围为0.4-8mm，优选为0.5-5mm。
10、优选地，所述血浆中神经细胞来源的外泌体包括神经元外泌体和/或胶质细胞外泌体。
11、优选地，所述步骤s1）中的血浆在与抗体包被的磁性颗粒进行混合之前经过预处理，通过所述预处理去除血浆中的大颗粒成分；其中，所述预处理过程优选包括：向待预处理的原血浆中添加 peg试剂，静置至少1分钟后进行离心作用得到沉淀物，将所述沉淀物采用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的pbs溶液进行重悬，得到预处理后的血浆。
12、优选地，所述抗体包被的磁性颗粒的制备步骤包括：
13、a1)、将磁性颗粒与经mes缓冲液稀释的羧基活性试剂进行混合，得到磁性颗粒混合液；
14、a2)、在旋转作用力作用下对步骤a1）得到的磁性颗粒混合液进行常温活化处理，得到活化处理的磁性颗粒混合液；
15、a3)、向步骤a2）得到的活化处理的磁性颗粒混合液中添加抗体，然后在旋转作用力作用下实现抗体与所述磁性颗粒的常温偶联，得到实现抗体-磁性颗粒偶联混合液；
16、a4)、将步骤a3）得到的抗体-磁性颗粒偶联混合液经冰浴超声波和/或离心清洗后，添加封存液对其进行封闭处理，得到实现抗体包被效果的磁性颗粒；
17、a5)、对步骤a4）得到的实现抗体包被效果的磁性颗粒进行清洗，去除未结合的抗体和/或其它非特异性结合物，然后置于封存液中进行存储。
18、优选地，在所述步骤a4）中，在所述离心清洗过程中，采用抗体稀释液对离心沉淀物进行1次或多次重悬，在每次重悬后进行离心清洗。
19、优选地，在所述步骤s2）中，在通过磁场作用分离所述磁性颗粒和与神经细胞来源的外泌体特异性结合的抗体过程中，对分离得到上清液至少进行一次清洗；其中，优选采用甘氨酸进行清洗；和/或在所述步骤s3）中的离心方式纯化过程中，对得到的沉淀物采用缓冲溶液至少进行一次洗涤。
20、优选地，采用电镜、蛋白免疫印迹或免疫荧光技术对步骤s3）得到的纯化的神经细胞来源的外泌体进行分析。
21、本专利技术利用了具有神经细胞外泌体特异性识别的突触素蛋白（synaptophysin,本文全部简称为“syp”）抗体包被的磁性颗粒来富集和纯化血浆中神经细胞来源的外泌体；在实施过程中，首先通过特定抗体和磁性颗粒（具体优选采用琼脂糖磁性颗粒）进行特异性结合，然后通过磁场来分离磁性颗粒和与之结合的神经细胞来源的外泌体（与抗体特异性结合），对血浆中神经细胞来源的外泌体进行富集，再经过纯化处理后即可得到纯化的神经细胞来源的外泌体；本申请提供的技术方案至少具有如下优点：
22、1)选择性富集：通过使用特定的神经细胞外泌体特异的抗突触素蛋白syp抗体，可以有选择性地富集神经细胞来源的外泌体亚群，这种选择性能够帮助研究者更好地获取目标外泌体种类。
23、2)高纯度：这种方法通常能够获得较高纯度的外泌体样本，因为通过神经细胞特异的抗体包被，能够特异性地捕获几乎所有神经细胞来源的外泌体，减少了非特异性结合或杂质的影响。
24、3)相对快速：相对于某些其他提取方法，抗体包被的琼脂糖磁珠颗粒富集提取外泌体相对快速，特别是在小样本量情况下。
25、4本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体，优选为小鼠抗人突触素蛋白特异性的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述磁性颗粒为琼脂糖磁性颗粒。
4.根据权利要求1或3所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述磁性颗粒的直径范围为0.4-8mm，优选为0.5-5mm。
5.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述血浆中神经细胞来源的外泌体包括神经元外泌体和/或胶质细胞外泌体。
6.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述步骤S1）中的血浆在与抗体包被的磁性颗粒进行混合之前经过预处理，通过所述预处理去除血浆中的大颗粒成分；其中，所述预处理过程优选包括：向待预处理的原血浆中添加 PEG试剂，静置至少1分钟后进行离心作用得到沉淀物，将所述沉淀物采用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制
7.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述抗体包被的磁性颗粒的制备步骤包括：
8.根据权利要求7所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，在所述步骤a4）中，在所述离心清洗过程中，采用抗体稀释液对离心沉淀物进行1次或多次重悬，在每次重悬后进行离心清洗。
9.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，在所述步骤S2）中，在通过磁场作用分离所述磁性颗粒和与神经细胞来源的外泌体特异性结合的抗体过程中，对分离得到上清液至少进行一次清洗；其中，优选采用甘氨酸进行清洗；和/或在所述步骤S3）中的离心方式纯化过程中，对得到的沉淀物采用缓冲溶液至少进行一次洗涤。
10.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，采用电镜、蛋白免疫印迹或免疫荧光技术对步骤S3）得到的纯化的神经细胞来源的外泌体进行分析。
...【技术特征摘要】
1.一种提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体，优选为小鼠抗人突触素蛋白特异性的单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述磁性颗粒为琼脂糖磁性颗粒。
4.根据权利要求1或3所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述磁性颗粒的直径范围为0.4-8mm，优选为0.5-5mm。
5.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述血浆中神经细胞来源的外泌体包括神经元外泌体和/或胶质细胞外泌体。
6.根据权利要求1所述提取血浆中神经细胞来源的外泌体的方法，其特征在于，所述步骤s1）中的血浆在与抗体包被的磁性颗粒进行混合之前经过预处理，通过所述预处理去除血浆中的大颗粒成分；其中，所述预处理过程优选包括：向待预处理的原血浆中添加 peg试剂，静置至少1分钟后进行离心作用得...
【专利技术属性】
技术研发人员：向晖刘，陈胜胜，朱训良，朱伟东，汪春芳，
申请(专利权)人：苏州康和顺生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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