【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置、应用及检测试剂盒。
技术介绍
1、膀胱癌是泌尿系统中发病率第二位的肿瘤，具有多中心发生和易复发的特点，临床统计发现，5年内复发率高达50～70％。就目前的临床检测手段而言，经尿道膀胱镜检查结合病理活检是膀胱癌诊断的金标准，但膀胱镜检查属侵入性检查，患者除了有一定痛苦之外，还可能会导致尿路感染等并发症，这些因素降低了患者依随性，限制了膀胱镜检查在临床中的应用。膀胱癌常用的诊断方法还有尿脱落细胞学检查、尿液fish检测、肿瘤标记物检查等，但其中尿脱落细胞学检查的灵敏度低，尿液fish检测操作复杂、判读结果具有主观性，肿瘤标记物检查主要针对尿液中的特定蛋白质类标记物，敏感性及特异性仍不十分理想。因此，在临床工作中，寻求一种方便、有效、无创的膀胱癌诊断技术，或筛选检测具有高灵敏度和特异性的肿瘤标志物，用于取代或减少膀胱镜检查，对于膀胱癌的早发现、早诊断、早治疗，进而提高患者生存率，减轻国家和患者医疗负担，具有重要意义。
2、近年来对dna的甲基化与肿瘤的发生、发展关系的研究为早期诊断膀胱癌提供了新的途径，在临床的研究中发现，异常甲基化与肿瘤临床特点与病理学特征有较为密切的联系，在多种癌前病变中存在，表明dna甲基化异常是肿瘤发生早期最为常见的事件之一，并且与肿瘤的恶性度分级也有关系。通过检测尿液中脱落细胞的膀胱癌相关甲基化标志物，来诊断和监测膀胱癌的发生与发展，显示出其未来的应用价值。
3、基因启动子cpg岛甲基化是导致基
4、除此之外，在对尿沉渣进行肿瘤dna标记物检测的研究中，肿瘤检测的灵敏度始终较低。低级别和复发肿瘤是基于尿液的检测方法(包括标准细胞学、免疫荧光原位杂交和dna检测等)的最大挑战，因为这些肿瘤可能无法释放出足够的肿瘤细胞到尿液中，导致无法被检测到。肿瘤细胞脱落到尿液中取决于肿瘤的特征，例如大小、阶段和级别，并且还表现出很大的个体间差异。此外，膀胱癌患者的尿液中可能含有更多的其他细胞类型，包括白细胞，进一步降低基于尿液的肿瘤检测的灵敏度。因此，一种能够富集尿液样本中肿瘤细胞的方法可能会提高泌尿系统肿瘤检测的灵敏度和稳定性，尤其是对于非侵入性低级别肿瘤的检测。
5、源自上皮细胞的肿瘤细胞通常比白细胞大，并且可以利用这种大小差异来富集尿液中的肿瘤细胞。已有研究利用膜过滤器从尿液中制备上皮细胞，通过细胞学、荧光原位杂交(fish)、methylight等技术来检测膀胱癌，以提高从尿液样本中检测膀胱癌的灵敏度[3]。过滤器的孔径是基于细胞大小进行肿瘤细胞富集的关键参数，理想情况下，考虑到细胞在压力下的变形性，过滤孔应该足够大以排除正常细胞，并且足够小以保留肿瘤细胞。在一项通过过滤富集血液中稀有ctc的研究发现，8μm孔径的过滤器可以去除样本中99.9％的白细胞，同时保留85-100％的癌细胞[4]。但是，尿液样本在细胞和杂质的组成上都更加复杂，基于大小的肿瘤细胞富集比血液样本难度更大。尿液中含有多种细胞类型和难溶杂质，包括血液和上皮来源的细胞，以及盐类结晶等，这些细胞或难溶杂质的形态、分布和绝对数量在不同的病理状态下会发生巨大的变化。从膀胱内壁脱落的正常上皮细胞的存在对于基于细胞大小的肿瘤细胞富集来说也是一个较大的问题，因为这些细胞通常很大(20-100毫米)并且与肿瘤细胞大小重叠。而各种杂质对于后续核酸提取的效果也有很大的不利影响。
6、然而，目前通过过滤法富集肿瘤细胞的方法对于尿液样本无法取得理想效果，主要是由于尿液中丰富的、不同大小的细胞和杂质类型，在采用传统死端过滤时，极易形成滤饼层，极大地减小了滤膜的孔径，使过滤效果大打折扣。死端过滤也叫垂直过滤，是大部分微孔过滤(mf，微滤)，包括除菌过滤所采用的过滤形式，其液体的流动方向与过滤方向一致，随着过滤的进行，过滤膜表面形成的滤饼层或凝胶层厚度逐渐增大，流速逐渐降低。当过滤介质为孔径细小的超滤膜或微滤膜时料液中固形物含量很高时，采取死端过滤方式，流速将急速降低，因此死端过滤只能处理小体积的料液。切向流过滤是指液体流动方向与过滤方向呈垂直方向的过滤形式，通常用于较大规模的料液过滤时，液体流动在过滤介质表面产生剪切力，减小了滤饼层或凝胶层的堆积，保证了稳定的过滤速度。因此切向流过滤方式被广泛地应用于超滤(uf)和部分的微滤(mf)的处理过程。检测尿液样本中的肿瘤细胞，样本量过少可能不足以获得足够的肿瘤细胞，但样本量又不足以在常规过滤条件下实现切向流，因此，对于尿液中肿瘤细胞的分选、富集和纯化，目前尚缺少简单而有效的方法。
技术实现思路
1、本专利技术主要是解决现有技术中存在的不足，提供一种经过简单、低成本的操作，富集与纯化肿瘤细胞，使健康人与肿瘤患者的甲基化检测结果差异更显著，可有效提高所有基于尿液样本中肿瘤脱落细胞的各种癌症的检测灵敏度；同时，大大减少了尿液中的杂质，提高了后续核酸提取和甲基化检测实验的成功率，及检测结果的稳定性的一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置、应用及检测试剂盒。
2、本专利技术的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：
3、一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置，包括收集管，设在收集管上端且与收集管拧紧固定的管盖，所述的收集管中设有与收集管相配接的过滤器，所述的过滤器中设有可更换规格的过滤膜，液体通过过滤膜进行过滤操作且过滤后的液体流至收集管中。
4、作为优选，所述的收集管与管盖形成可立离心管，所述的过滤器的上部为近圆柱形管腔，所述的过滤器的下部为扁状形网栅且过滤膜设在扁状形网栅的内壁。
5、作为优选，所述的扁状形网栅的侧面呈深v形或深u形结构，正面为宽u型结构，过滤膜设在扁状形网栅的前后两面。
6、纯化分选装置，包括收集管，设在收集管上端且与收集管拧紧固定的管盖，所述的收集管中设有与收集管相配接的过滤器，所述的过滤器中设有可更换规格的过滤膜，液体通过过滤膜进行过滤操作且过滤后的液体流至收集管中。
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【技术保护点】
1.一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置，其特征在于：包括收集管(2)，设在收集管(2)上端且与收集管(2)拧紧固定的管盖(1)，所述的收集管(2)中设有与收集管(2)相配接的过滤器(6)，所述的过滤器(6)中设有可更换规格的过滤膜(5)，液体通过过滤膜(5)进行过滤操作且过滤后的液体流至收集管(2)中。
2.根据权利要求1所述的一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置，其特征在于：所述的收集管(2)与管盖(1)形成可立离心管，所述的过滤器(6)的上部为近圆柱形管腔，所述的过滤器(6)的下部为扁状形网栅(4)且过滤膜(5)设在扁状形网栅(4)的内壁。
3.根据权利要求2所述的一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置，其特征在于：所述的扁状形网栅(4)的侧面呈深V形或深U形结构，正面为宽U型结构，过滤膜(5)设在扁状形网栅的前后两面。
4.一种利用尿液样本进行泌尿系统肿瘤检测的应用，该应用使用权利要求1-3中任意一项所述的分选纯化装置，其特征在于：使用分选纯化装置对尿液中的肿瘤细胞进行分选与纯化；尿液中体积
5.根据权利要求4所述的一种利用尿液样本进行泌尿系统肿瘤检测的应用，其特征在于：检测的肿瘤标志物是DNA、RNA、糖类、脂类、蛋白质及小分子化合物其中的一种；所述泌尿系统肿瘤为膀胱癌。
6.一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，该应用使用权利要求4-5中任意一项所述的应用，其特征在于：所述的检测的肿瘤标志物为DNA甲基化标志物，DNA甲基化标志物包括DMR5至DMR12中的至少一种所示序列；或其完全互补序列。
7.根据权利要求5所述的一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特征在于：DNA甲基化标志物组合为DMR8和DMR12所示序列的组合；或其完全互补序列的甲基化标志物组合。
8.根据权利要求5所述的一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特征在于：DNA甲基化标志物组合为DMR3、DMR8和DMR12所示序列的组合；或其完全互补序列的甲基化标志物组合。
9.一种膀胱癌检测试剂盒，该试剂盒使用权利要求6-8中任意一项所述的应用，其特征在于：利用下述方法中的至少一种检测所述的DNA甲基化标志物的甲基化水平：甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性荧光定量PCR法(MS-qPCR)、高分辨率熔解曲线法、限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化敏感限制性内切酶(MSRE)法、焦磷酸测序法、亚硫酸氢盐测序、甲基化DNA免疫共沉淀技术(MeDIP)、高效液相层析技术(HPLC)、基于芯片的甲基化图谱分析、飞行质谱；检测DNA甲基化标志物的甲基化水平，来诊断膀胱癌。
10.根据权利要求9所述的一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于：包括检测权所述的DNA甲基化标志物组合的甲基化程度的试剂。
11.根据权利要求9所述的一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于：采用荧光定量PCR平台检测，检测试剂盒包括针对每个DNA甲基化标志物的扩增引物和荧光探针，以及热启动酶和qPCR反应液。
12.根据权利要求11所述的一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于：包括DNA甲基化标志物DMR3、DMR8和DMR12对应的上游引物、下游引物和探针组合；
13.根据权利要求4-12任意一项所述的一种利用尿液样本进行泌尿系统肿瘤检测的应用，其特征在于按以下步骤进行：
...【技术特征摘要】
1.一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置，其特征在于：包括收集管(2)，设在收集管(2)上端且与收集管(2)拧紧固定的管盖(1)，所述的收集管(2)中设有与收集管(2)相配接的过滤器(6)，所述的过滤器(6)中设有可更换规格的过滤膜(5)，液体通过过滤膜(5)进行过滤操作且过滤后的液体流至收集管(2)中。
2.根据权利要求1所述的一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置，其特征在于：所述的收集管(2)与管盖(1)形成可立离心管，所述的过滤器(6)的上部为近圆柱形管腔，所述的过滤器(6)的下部为扁状形网栅(4)且过滤膜(5)设在扁状形网栅(4)的内壁。
3.根据权利要求2所述的一种用于泌尿系统肿瘤检测的尿液中肿瘤细胞分选纯化装置，其特征在于：所述的扁状形网栅(4)的侧面呈深v形或深u形结构，正面为宽u型结构，过滤膜(5)设在扁状形网栅的前后两面。
4.一种利用尿液样本进行泌尿系统肿瘤检测的应用，该应用使用权利要求1-3中任意一项所述的分选纯化装置，其特征在于：使用分选纯化装置对尿液中的肿瘤细胞进行分选与纯化；尿液中体积较大的肿瘤细胞大部分被富集在尿脱落细胞纯化分选装置的过滤膜上，加入核酸提取试剂中的细胞裂解液并离心收集滤液，即可进一步进行核酸提取及后续检测；
5.根据权利要求4所述的一种利用尿液样本进行泌尿系统肿瘤检测的应用，其特征在于：检测的肿瘤标志物是dna、rna、糖类、脂类、蛋白质及小分子化合物其中的一种；所述泌尿系统肿瘤为膀胱癌。
6.一种用于膀胱癌检测的dna甲基化标志物组合，该应用使用权利要求4-5中任意一项所述的应用，其特征在于：所述的检测的肿瘤标志物为dna甲基化标志物，dna甲基化标志物包括dmr5至dmr12中的至少一种所...
【专利技术属性】
技术研发人员：施聪，陈琴玉，蒋青霞，
申请(专利权)人：杭州昱鼎生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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