【技术实现步骤摘要】
本专利技术主要涉及生物制药领域，尤其工程化抗体和抗体-药物偶联物。
技术介绍
1、抗体是多功能的免疫球蛋白，具有对靶抗原独特的结合特异性以及一系列非抗原依赖性免疫相互作用，由此在免疫系统中发挥着重要作用。当前使用的许多治疗用生物药、诊断试剂和研究试剂是针对感兴趣的病理、免疫机制或生物学机制相关抗原的抗体。
2、近年来，人们为开发带有药物载荷的抗体偶联物做出了大量的努力。就抗体药物偶联物(adc)而言，adc包含用于靶向的抗体，用于药物附接的连接子和作为效应物的强效的药物载荷。抗体或其相关形式通过抗体-抗原相互作用将细胞毒性药物带向表达抗原的细胞或其他靶细胞。同时，药物与抗体偶联后毒性显著下降。因此，adc通过降低最小有效剂量(med)和提高最大耐受剂量(mtd)扩大了治疗窗口。fda批准的adc药物有例如mylotarg、adcetris、kadcyla、besponsa、polivy、padcev、enhertu、trodelvy和blenrep。
3、adc研发成功依赖于抗体的选择、连接子-药物载荷的选择、连接子-药物载荷的偶联方式以及偶联过程的研发。抗体中的半胱氨酸巯基作为强亲核试剂是理想的偶联反应基团。抗体的天然形式中，半胱氨酸残基以二硫键形式存在，因此，抗体轻链与重链之间的二硫键还原为偶联提供了理想的游离半胱氨酸巯基。为了应对优选药物载荷-抗体比(par)和偶联位置的相关机遇与挑战，本领域开发了多种偶联方法。理想情况下，应将适量的药物载荷连接到抗体，由此得到的是异质性的adc产品。低par的偶联
4、一种方法采用对抗体进行点突变来引入具有高反应性残基的氨基酸供偶联之用。thiomabtm技术由基因泰克(genentech)公司开发，通过诱导抗体上的半胱氨酸突变(jagathr junutula,等,细胞毒性药物与抗体位点特异性偶联改进治疗指数(site-specificconjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeuticindex),nature biotechnology,2008,26(8):925–932)。与thiomab的偶联发生在还原后的经改造的半胱氨酸残基上，产生了高均质性的偶联产物。非天然氨基酸(nnaa)技术也用于生产均质性的偶联物。例如，用非天然氨基酸在抗体中引入酮基或叠氮基作为偶联位点(jun y.axup,等,使用非天然氨基酸合成位点特异性抗体-药物偶联物(synthesis ofsite-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids),pnas,2012,109(40):16101-16106；michael p.vanbrunt,等,在哺乳动物细胞中遗传编码含有氨基酸的叠氮化物，使用点击环加成化学能够实现位点特异性抗体-药物偶联物(genetically encoded azide containing amino acid in mammalian cells enablessite-specific antibody–drug conjugates using click cycloaddition chemistry),bioconjugate chem.,2015,26(11):2249-2260)，由于特异性反应，也得到了高度均质的产物。
5、基于点突变的方法存在一些缺点。首先，需要仔细选择突变位点，否则抗体的稳定性和结合效率都会受到影响。其次，点突变抗体的表达水平通常很低，这在化学成分生产和控制(cmc)阶段会成为问题。
6、另一种方法是引入可被酶识别的短多肽标签作为偶联位点。谷氨酰胺标签(llqg)作为mtg识别基序(pavel strop等，“位点的重要性：结合位点调节抗体药物偶联物的稳定性和药代动力学(location matters:site of conjugation modulates stability andpharmacokinetics of antibody drug conjugates)”,chemistry&biology,2013,20(2):161-167)，lpetg作为分选酶a识别基序(roger r.beerli等，“分选酶介导形成体外体内高效力的位点特异性抗体药物偶联物(sortase enzyme-mediated generation of site-specifically conjugated antibody drug conjugates with high in vitro and invivo potency)”，plos one,2015,10(7):e0131177)、以及lcxpxr作为甲酰基甘氨酸生成酶(fge)识别基序(peng wu等，“用遗传编码醛标签在哺乳动物细胞中产生的定点化学修饰的重组蛋白(site-specific chemical modification of recombinant proteins producedin mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag)”，pnas,2009,106(9):3000-3005)用于偶联获得了高度均质的产物，其中，药物连接于多肽标签。
7、短多肽标签的缺点与基于点突变的方法相似。需要筛选多肽标签的插入位点，而多肽标签的可用位点是有限的。并且，使用该策略时带标签抗体的表达滴度也是个难点。
8、生产抗体偶联物最直接的方法是利用抗体重链多肽和轻链多肽中天然半胱氨酸的巯基。巯基作为一种强亲核试剂，可在水相中实现快速高效的偶联反应。在fda批准的adc药物例如adcetris和polivy中，通过半胱氨酸残基上的巯基与用于单甲基澳瑞他汀e(mmae)的连接子中的马来酰亚胺基团反应从而将mmae偶联在部分还原链间二硫键产生的半胱氨酸残基上。在此优选部分还原而非完全还原是因为药物的疏水性和所有半胱氨酸残基有连接时的位阻导致adc药物在血浆中不稳定。然而，部分还原后制得的产品均质性很差，对cmc造成了困难，特别是偶联过程的控制和qc达标分析。另一方面，adc混合物中具有不同dar的物质在体内显示出不同的稳定性和疗效，这意味着在异质adc产品中并非所有物质都符合预期结构型式。
9、igg亚类igg1、igg2、igg3和igg4之间在二硫键结构方面有许多相似之处和不同之处。以最常用作治疗用生物药的igg1和igg4为例，igg1和igg4的两条重链都通过两个二硫键连接并且总共有12个链内二硫键；然而，igg1的轻链通过其最后一个残基与重链第五个半胱氨酸残基之间的二硫键与重链相连，而igg4的轻链通过其最后一个半本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化二聚体抗体，其中第一单体包含第一Fab结构域和与之可操作性连接的第一工程化铰链区以及在此之后与该铰链区可操作性连接的第一Fc区，第二单体包含第二Fab结构域和与之可操作性连接的第二铰链区以及在此之后与该铰链区可操作性连接的第二Fc区；
2.如权利要求1所述的工程化抗体，其中，所述第二单体是含有TCR恒定结构域的WuXiBodyTM抗体半抗体。
3.如权利要求1所述的工程化抗体，其中，所述抗体Fab结构域是人IgG1型的；且/或所述Fv结构域是人IgG类的。
4.如权利要求1所述的工程化抗体，其中所述Fc结构域是人IgG1或人IgG4型的。
5.如权利要求1所述的工程化抗体，其中，所述第一Fc区包含臼突变，所述第二Fc区包含杵突变。
6.如权利要求1所述的工程化抗体，其包含，
7.一种抗体-药物偶联物，其包含通过连接子偶联一个或多个药物分子的权利要求1所述的工程化抗体。
8.如权利要求7所述的抗体-药物偶联物，其特征在于以下一项或多项：
9.一种组合物，其包含权利要求7所述
10.一种药物组合物，其包含权利要求7所述的抗体-药物偶联物和药学上可接受的载体。
11.一种制备权利要求7所述的抗体-药物偶联物的方法，其包括部分还原的权利要求1所述抗体与带有马来酰亚胺或卤代乙酰基部分的连接子-药物载荷化合物通过迈克尔加成反应偶联。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括用温和还原剂对权利要求1所述的工程化抗体进行部分还原以提供所述部分还原的抗体。
13.如权利要求12所述的方法，具有一项或多项以下特征：
14.如权利要求13所述的方法，具有以下一项或多项特征：
15.如权利要求13所述的方法，具有以下一项或多项特征：
16.一种用权利要求13所述方法获得的抗体-药物偶联物产品，其包含权利要求7所述抗体-药物偶联物的混合物或由所述抗体-药物偶联物的混合物组成，其中，至少65％的抗体-药物偶联物的药物/抗体比为2；或者，所述抗体-药物偶联物产品包含权利要求7所述抗体-药物偶联物的混合物或由所述抗体-药物偶联物的混合物组成，其中，至少80％的抗体-药物偶联物的药物/抗体比为6。
17.权利要求7所述的抗体-药物偶联物用于制造治疗癌症例如乳腺癌的药物的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种工程化二聚体抗体，其中第一单体包含第一fab结构域和与之可操作性连接的第一工程化铰链区以及在此之后与该铰链区可操作性连接的第一fc区，第二单体包含第二fab结构域和与之可操作性连接的第二铰链区以及在此之后与该铰链区可操作性连接的第二fc区；
2.如权利要求1所述的工程化抗体，其中，所述第二单体是含有tcr恒定结构域的wuxibodytm抗体半抗体。
3.如权利要求1所述的工程化抗体，其中，所述抗体fab结构域是人igg1型的；且/或所述fv结构域是人igg类的。
4.如权利要求1所述的工程化抗体，其中所述fc结构域是人igg1或人igg4型的。
5.如权利要求1所述的工程化抗体，其中，所述第一fc区包含臼突变，所述第二fc区包含杵突变。
6.如权利要求1所述的工程化抗体，其包含，
7.一种抗体-药物偶联物，其包含通过连接子偶联一个或多个药物分子的权利要求1所述的工程化抗体。
8.如权利要求7所述的抗体-药物偶联物，其特征在于以下一项或多项：
9.一种组合物，其包含权利要求7所述抗体-药物偶联物的混合物或由所述抗体-药物偶联物的混合物组成，其中，至少65％的所述抗体-药物偶联物的药物/抗体比为2；或其中，至少80％...
【专利技术属性】
技术研发人员：金明志，陈晓悦，李满荣，姜来，阴丽，蔡洁行，王俊，
申请(专利权)人：上海药明合联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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